В этом видео демонстрируется использование бактериальной системы экспрессии внеклеточного белка на основе сырого лизата Vibrio natriegens для выполнения сопряженной транскрипции и трансляции in vitro. В нем особое внимание уделяется приготовлению мастер-микса с необходимыми компонентами и поэтапному синтезу функциональных белков из матрицы ДНК.
Подготовить рабочие массы Mg-глутамата и К-глутамата в пробирках объемом 50 мл со стерильной DI (деионизированной) водой в концентрациях 100 мМ и 2000 мМ соответственно.
Приготовьте рабочую массу из 50% (w/v) полиэтиленгликоля (ПЭГ)-8000, добавив 100 мл стерильной воды DI в стакан объемом 250 мл. Поместите в стакан небольшую магнитную мешалку. Взвесьте 50 г PEG-8000 и добавьте в 100 мл воды в стакане.
Поместите стакан на нагретую пластину для перемешивания, установленную на 100 °C, и помешивайте со скоростью 250 об/мин, пока PEG-8000 не окажется в растворе. Дайте жидкой смеси PEG-8000 остыть перед переносом в пробирки объемом 50 мл.
Мастер-микс энергетических решений
Приготовьте 5 М раствор KOH, добавив 140 г гранул KOH в 500 мл стерильной воды ДВ. ОСТОРОЖНОСТЬ: Готовьте этот раствор в химическом капюшоне и надевайте СИЗ при работе с прочными основаниями. Раствор станет горячим, поэтому крышка бутылки должна быть ослаблена, чтобы предотвратить повышение давления. Перед использованием дайте раствору KOH достичь RT.
Приготовьте буфер HEPES-Koh 1750 мМ, добавив 20,85 г HEPES во флакон объемом 100 мл. Медленно добавляйте стерильную деионизионную воду, пока объем не достигнет 40 мл. Вихревой флакон для растворения HEPES. С помощью 5 М раствора KOH отрегулируйте pH до 8,0, а затем доведите объем раствора до 50 мл. ОСТОРОЖНОСТЬ: При регулировке pH с KOH следует обращаться с надлежащими СИЗ.
Приготовьте оставшиеся 10x energy master mix исходные компоненты в концентрациях, указанных в таблице 1 , в стерильной деионизированной воде и поместите каждый бульон на лед. Разморозьте 100 мМ запасы ATP, GTP, CTP и UTP в RT и поместите на лед. ЗАМЕТКА: При необходимости для растворения реагентов в растворе можно использовать термомиксер, настроенный на 37 °C и 350 об/мин. Не перегревайте и не оставляйте реагенты на термомиксере в течение длительного периода времени.
В пробирку объемом 15 мл добавьте каждый компонент мастер-смеси энергетического раствора в соответствии с порядком и объемом, указанным в таблице 1. Вортексируйте раствор после добавления каждого компонента. Это составит 5 мл 10-кратного энергетического раствора мастер-микса.
Разделите 10-кратную основную смесь энергетического раствора на аликвоты по 200 мкл в пробирках по 2 мл. Заморозьте каждую аликвоту. Немедленно поместите их в морозильную камеру при температуре -80 °C до использования.
Мастер-микс аминокислот
Чтобы приготовить свежую мастер-смесь 4x аминокислот, начните с размораживания каждого аминокислотного запаса в RT, а затем положите каждую на лед. Используйте вихревой и/или термомиксер, установленный на 37 °C и 350 об/мин, чтобы убедиться, что все запасы аминокислот полностью растворены. ЗАМЕТКА: Цистеин может не растворяться полностью; Его можно добавлять в мастер-смесь аминокислот в виде суспензии. Не перегревайте и не оставляйте реагенты на термомиксере в течение длительного периода времени.
В пробирку объемом 15 мл добавьте соответствующий объем аминокислот к стерильной воде DI так, чтобы конечная концентрация каждой из них составляла 8 мМ в следующем порядке: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU и CYS. Добавив каждую аминокислоту, сделайте вихревой раствор мастер-смеси. Объемы, указанные в таблице 1 , составят 2,4 мл мастер-смеси аминокислот.
Разделите мастер-смесь 4x аминокислот на 200 мкл аликвот в 2 мл пробирок. Заморозьте каждую аликвоту. Немедленно поместите в морозильную камеру при температуре -80 °C до использования.
Производство готовой к реакции плазмидной ДНК-матрицы ЗАМЕТКА: Экспрессия внеклеточного белка в этой системе была оптимизирована с помощью вектора экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) T7-pJL1-sfGFP (Таблица материалов). Рекомендуется использовать эту плазмиду в качестве контроля эффективности внеклеточной реакции и в качестве основы pJL1 для клонирования и экспрессии других белковых последовательностей. Могут быть использованы другие шаблоны плазмидной ДНК; однако важно отметить, что транскрипция контролируется последовательностью промотора Т7 и наличием РНК-полимеразы Т7. Ниже описан простой протокол для широкомасштабного производства любой плазмидной ДНК-матрицы из трансформированной E. coli .
Очистите нужный вектор с помощью набора для очистки плазмид в соответствии с инструкцией производителя (Таблица материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется максимально концентрировать матрицу плазмидной ДНК для соблюдения жестких ограничений по объему бесклеточной реакции. В целом, стремитесь к рабочему составу 750−1500 нг/μл.
2. Проведение реакций экспрессии внеклеточных белков с использованием сырого экстрактаV. natriegens
Внеклеточная экспрессия белка с помощью плазмиды или линейной матрицы ДНК
Выньте 10x Energy Solution master mix и 4x amino acid master mix aliquots из морозильной камеры при -80 °C, разморозьте при RT и положите на лед. Извлеките запасы РНК-полимеразы Т7 и ингибитора РНКазы из морозильной камеры при температуре -20 °C и положите их на лед. Разморозьте шаблон ДНК в RT и положите на лед.
Приготовьте бесклеточную реакционную мастер-смесь в соответствии с Таблицей 2 , добавив каждый компонент в следующую пробирку объемом 2 мл на льду: мастер-смесь аминокислот, мастер-смесь энергетического раствора, Mg-глутамат, К-глутамат, ДНК-матрица, PEG-8000, РНК-полимераза T7 и ингибитор РНКазы. Аккуратно переворачивайте тюбик после каждого добавления в мастер-микс. ЗАМЕТКА: Если для экспрессии внеклеточного белка необходимо использовать линейную матрицу, добавьте в нее в 5-10 раз больше материала по сравнению с плазмидной матрицей, чтобы получить заметный выход белка.
Извлеките сырой клеточный лизат V. natriegens из морозильных камер при температуре -80 °C и положите на лед на 10−20 минут до оттаивания. Добавьте соответствующий объем сырого клеточного экстракта в бесклеточную реакционную мастер-смесь в соответствии с Таблицей 2 и осторожно перемешайте, перелистывая или пипетируя вверх и вниз.
Экспрессия бесклеточного белка в конечной точке с помощью термоамплификатора
Пипетка 10 мкл бесклеточной реакционной мастер-смеси на дно 96- или 384-луночного ПЦР-планшета. Между каждым переносом на планшет для ПЦР перемешивайте основную смесь, осторожно переворачивая пробирку. ЗАМЕТКА: Бесклеточный реакционный мастер-микс всегда должен быть хорошо перемешан для обеспечения максимальной воспроизводимости реакции и экспрессии бесклеточного белка во всех образцах.
Кратковременно центрифугируйте планшет при давлении 1 000 x g в течение 10 с, чтобы собрать любую исходную смесь, которая могла застрять на стенках лунок. Запечатайте лунки пластинчатым клеем, чтобы предотвратить испарение, а затем поместите ПЦР-планшет в термоамплификатор, установленный при температуре 26 °C, с крышкой с подогревом, установленной на 105 °C. ЗАМЕТКА: Равномерное распределение тепла и нагреваемая крышка термоамплификатора значительно улучшают выход экспрессии белка.
Инкубируйте бесклеточные реакции в течение не менее 3 часов. После инкубации экспрессированные белки могут быть очищены, количественно определены и использованы для последующих процессов. ЗАМЕТКА: Экспрессированные белки могут быть непосредственно количественно определены в бесклеточной реакции с использованием метода, выбранного пользователем. Например, флуоресцентные белки могут быть количественно определены с помощью внешней стандартной кривой, или радиоактивность может быть измерена при использовании радиоактивно меченной аминокислоты в бесклеточной реакции. Спектроскопия в УФ-видимом диапазоне или анализы общего белка, как правило, не рекомендуются для прямого измерения продукции белка в бесклеточных реакциях без начальной очистки.
Таблица 1: Реагенты для приготовления 5 мл 10-кратного энергетического раствора мастер-смеси и 2,4 мл 4-кратного аминокислотного мастер-микса.