Мониторинг роста бактерий в режиме реального времени с помощью микрофлюидной системы микрокапельного культивирования

Аннотация

Источник: Jian, X. et al., Автоматизированное микробное культивирование и адаптивная эволюция с использованием микробной системы микрокапельного культивирования (MMC). J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется использование микрофлюидной платформы на основе капель для мониторинга роста бактерий в режиме реального времени. Генерируя однородные капли, содержащие бактериальные суспензии, и направляя их по пути обнаружения, система позволяет непрерывно измерять плотность клеток для построения кривой роста.

Протокол

1. Подготовка

1. Подсоедините иглу шприца (внутренний диаметр 0,41 мм, внешний диаметр 0,71 мм), быстроразъемный соединитель А и флакон с реагентом (рис. 1C) и автоклавируйте их при температуре 121 °C в течение 15 минут.
   ЗАМЕТКА: Во время стерилизации слегка открутите крышку флакона с реактивом. Каждый раз можно готовить еще несколько флаконов с реагентами для использования.
2. Используйте фильтр из поливинилиденфторида (PVDF) длиной 0,22 мкм для фильтрации масла системы культивирования микрокапель (MMC). Заранее поместите микрофлюидный чип (рис. 1B) и масло MMC на чистую полку и простерилизуйте их ультрафиолетовым облучением в течение 30 минут перед использованием.
   ЗАМЕТКА: Подробная информация о быстроразъемном соединителе А, флаконе с реагентом, масле MMC и микрофлюидном чипе приведена в Таблице материалов.
3. Установка микрофлюидного чипа
   1. Откройте дверцу операционной камеры (рис. 1A) и поднимите оптоволоконный щуп.
   2. Совместите отверстия электрического поля с иглами электрического поля и аккуратно поместите чип на пьедестал для чипа. Затем вставьте две позиционирующие колонки в позиционные отверстия и опустите оптоволоконный щуп (рис. 1D).
   3. Подключите быстроразъемный разъем A на микросхеме к соответствующему порту MMC в соответствии с номером позиции (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Затем закройте дверцу операционной камеры.
4. Пополните запас масла MMC (примерно до 80 мл) в бутылке с маслом и слейте отработанную жидкость в бутылку для отходов перед использованием.
   ЗАМЕТКА: Отработанная жидкость обычно является органическими отходами. Пожалуйста, ознакомьтесь с региональным законодательством и нормативными актами при утилизации, которые могут быть изменены в зависимости от экспериментальной установки.

2. Измерение кривой роста в ГМК

1. Приготовление исходного бактериального раствора
   1. В соответствии с соответствующими стандартными нормами подготавливайте среду Luria-Bertani (LB) и автоклав при температуре 121°C в течение 15 минут.
      ЗАМЕТКА: Компоненты среды LB: NaCl (10 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л) и триптон (10 г/л).
   2. Извлеките штамм Escherichia coli (E. coli) MG1655 из глицеринового подвоя и культивируйте его в колбе объемом 50 мл с 10 мл среды LB в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 5-8 часов.
      ЗАМЕТКА: Время выращивания зависит от конкретных сортов. Оптимально культивировать сорт в логарифмическом периоде/фазе.
   3. Разбавляют культивируемый раствор E. coli MG1655 свежей средой до оптической плотности на 600 нм (наружный диаметр₆₀₀) 0,05-0,1 до получения исходного бактериального раствора (готовят около 10 мл).
2. Нажмите кнопку «Инициализация », чтобы инициализировать MMC. После того как появится интерфейс инициализации, установите температуру выращивания 37 °C и значение фотоэлектрического сигнала 0,6 (рис. 2A). Инициализация займет около 20 минут.
3. Включите ультрафиолетовую (УФ) лампу (длина волны 254 нм) во время инициализации.
4. Введите исходный раствор бактерий и масло MMC во флакон с реагентом.
   1. Достаньте на чистую скамью стерилизованный флакон с реактивом и закрутите крышку.
   2. С помощью стерильного шприца объемом 10 мл введите 3-5 мл масла MMC из иглы шприца боковой трубки. Медленно наклоняйте и вращайте флакон с реагентом, чтобы масло полностью проникло во внутреннюю стенку.
   3. Введите около 5 мл исходного раствора бактерий, а затем заполните флакон с реагентом, снова введя 5-7 мл масла.
   4. Вытяните независимый быстроразъемный соединитель A и вставьте быстроразъем A флакона с реагентом в быстроразъемный разъем B, чтобы завершить операцию впрыска образца (рис. 3A).
5. Дождитесь окончания инициализации, а затем выключите УФ-лампу (длина волны 254 нм).
6. Откройте дверцу операционной камеры и поместите флакон с реагентом в металлическую ванну.
7. Вытяните разъем C2 микросхемы и быстроразъемный разъем A флакона с реагентом. Подсоедините боковую трубку флакона с реагентом к разъему C2, а разъем верхней трубки — к разъему O2. Затем закройте дверцу операционной камеры.
8. Нажмите на Кривая роста, чтобы выбрать функцию измерения кривой роста (Рисунок 2A). В интерфейсе настройки параметров введите Число как 15, включите переключатель обнаружения OD и установите Длину волны как 600 нм. Нажмите «Старт», чтобы начать генерацию капель. Это займет около 10 минут. ЗАМЕТКА: Здесь Number относится к количеству каплетов, которые должны быть сгенерированы. Длина волны относится к длине волны внешнего диаметра, который должен быть обнаружен. Установите Число (максимум 200) и Длину волны (350-800 нм) в соответствии с требованиями эксперимента.
9. Когда на главном интерфейсе появится всплывающее окно с предложением «Снимите флакон с реагентом между C2 и O2, затем нажмите кнопку OK после завершения», откройте дверцу операционной камеры, чтобы вынуть флакон с реагентом и подсоединить разъемы C2 и O2.
10. Закройте дверцу и нажмите кнопку OK во всплывающем окне, чтобы автоматически культивировать капли и определить значения OD.
    ЗАМЕТКА: MMC обнаруживает значение внешнего диаметра, когда капля проходит через оптоволоконный зонд. Таким образом, период обнаружения зависит от количества образующихся капель.
11. Когда кривая роста достигнет стационарной фазы, нажмите кнопку Экспорт данных , чтобы экспортировать данные OD. Выберите путь сохранения данных и экспортируйте значение OD, записанное в период выращивания, в формат .csv, который может быть открыт соответствующим программным обеспечением (например, Microsoft Excel). Затем используйте картографическое программное обеспечение (например, EXCEL и Origin 9.0) для построения кривой роста.
    ЗАМЕТКА: В процессе выращивания можно в любое время нажать на кнопку «Экспорт данных », чтобы экспортировать данные OD всех текущих капель.

Результаты

Рисунок 1: Структура и основные инструменты MMC. (А) Внешняя и оперативная палата ВВК. (B) Микрофлюидный чип MMC. Чип имеет семь каналов (C1-C6 и CF). (В) Флакон с реагентом. Он имеет верхнюю и боковую трубы. Перед введением образца во флакон с реагентом ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фильтрующая мембрана из ПВДФ 0,22 мкм	Мерк Миллипор Лтд.	SLGPR33RB	Стерилизуйте масло MMC
Холодильник 4 °C	Haier	БКД-289BSW	Для хранения реагентов
Агар	Бектон, Дикинсон и компания	214010	Для подготовки твердых пластин
Чистая скамейка	Пекин Дунлянь Хар Инструментостроительная Компания Ко., Лтд.	DL-CJ-INDII	Для асептической эксплуатации и УФ-стерилизации
Компьютер	Леново	Е450	Установка программного обеспечения и управление MMC
Инкубатор с постоянной температурой	Шанхайская компания Qixin Scientific Instrument Co., Ltd	ЛРХ 250	Для микробного культивирования с использованием твердой среды
Электронные весы	ОХАУС	АР 3130	Для взвешивания реагентов
Трубка EP	Термо Фишер	1,5 мл	Для сбора капель
Морозильная трубка	Термо Фишер	2,0 мл	Для сохранения штамма
Глицерин	ОБЩИЙ РЕАКТИВ	G66258A	Для сохранения штамма
Паровой стерилизационный бател высокого давления	САНЬО Электрик	MLS3020	Для автоклавной стерилизации
Микробная система культивирования микрокапель (MMC)	Лоян Тмакстри Биотехнология Ко., Лтд.	MMC-I	Определение кривой роста и адаптивная эволюция. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Микрофлюидный чип	Лоян Тмакстри Биотехнология Ко., Лтд.	ММЦ-АЛЕ-ОД	Для различных операций с каплями. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/
Масло ГМК	Лоян Тмакстри Биотехнология Ко., Лтд.	ММК-М/С-ОД	Масляная фаза для капельной микрофлюидики. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/
NaCl	ОБЩИЙ РЕАКТИВ	G81793J	Компонент среды LB
Чашка Петри	Корнинг Инкорпорейтед	90 мм	Для приготовления твердой среды
Пипетка	Эппендорф	2,5 μл, 10 μл, 100μл, 1000μл	Для работы с жидкостями
Быстроразъемный соединитель A	Лоян Тмакстри Биотехнология Ко., Лтд.	—	Для соединения каждого стыка. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/
Флакон с реактивами	Лоян Тмакстри Биотехнология Ко., Лтд.	MMC-PCB	Отбор проб и хранение раствора бактерий и реагентов. Пожалуйста, обратитесь к http://www.tmaxtree.com/en/
Встряхнуть колбу	«Юнион-Биотех»	50 мл	Для микробного культивирования
Встряхивающий инкубатор	Шанхай Сукун Индастриал Ко., Лтд.	СКАЙ-210 2Б	Для культивирования микроорганизмов в колбе
Шприц	ЦЗЯНСУ ЧЖИЮЙ МЕДИЦИНСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ КО., ЛТД	10 мл	Наберите жидкость и введите ее во флакон с реагентом
Игла для шприца	Хозяйственный магазин OUBEL	22Г	Внутренний диаметр составляет 0,41 мм, а внешний диаметр 0,71 мм.
Триптон	ООО «Оксоид»	ЛП0042	Компонент среды LB
Холодильник для ультранизких температур	SANYO Ультранизкий	МДФ-У4086С	Для сохранения деформации (-80 °C)
УФ-ВИД спектрофотометр	Компания «Дженерал Электрик»	Ultrospec 3100 pro	Для измерения значений наружного диаметра
Дрожжевой экстракт	ООО «Оксоид»	ЛП0021	Компонент среды LB