Естественная трансформация и экспрессия GFP в нитчатой цианобактерии Phormidium lacuna

Аннотация

Источник: Weber, N., et al., Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео описана процедура выполнения естественной трансформации нитевидных цианобактерий с использованием плазмидной ДНК для достижения стабильной экспрессии GFP и устойчивости к антибиотикам за счет гомологичной рекомбинации.

Протокол

1. Естественное преобразование и экспрессия GFP

ЗАМЕТКА: Трансформация основана на плазмидном векторе, размноженном в Escherichia coli (E. coli); В качестве основных векторов можно использовать pGEM-T или pUC19. Примеры векторов для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (sfGFP) в суперпапке описаны в разделе репрезентативных результатов.

1. Выполнять все этапы с использованием стерильного материала в стерильных лабораторных условиях (чистая скамья, стерильная стеклянная посуда).
2. Инокулируйте 2 x 50 мл жидкой среды f/2 в две колбы по 250 мл 2 x 1 мл нитей Phormidium lacuna (P. lacuna) из работающей культуры. Культивировать при белом свете (50 мкм ^{м-2 с-1}) при перемешивании (горизонтальное вращение, 50 об/мин) в течение ~5 дней при 25 °С.
3. Приготовьте ~200 мкг векторной ДНК трансформации с помощью набора для подготовки midi в соответствии с инструкциями производителя.
4. Гомогенизируйте 100 мл суспензии клеток P. lacuna (см. Таблицу материалов) при 10 000 об/мин в течение 3 мин. Измерьте наружный диаметр на длине волны 750 нм (желаемое значение = 0,35).
5. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 15 мин при 6000 × г. Удалите надосадочную жидкость и суспендируйте гранулу в 800 мкл (общий объем, включая остаточную жидкость и нити) оставшейся жидкости и дополнительной среды f/2⁺ .
6. Возьмите восемь бакто-агаровых планшетов f/2⁺ (диаметром 10 см), содержащих 120 мкг/мл канамицина. Пипеткой введите 10 г ДНК в середину каждой агаровой пластины. Немедленно внесите пипеткой 100 мкл клеточной суспензии в середину каждой агаровой пластины (поверх ДНК).
7. Держите агаровую пластину без крышки на чистом скамейке, чтобы лишняя жидкость испарилась. Закройте тарелку и выращивайте ее при белом свете при температуре 25 °C в течение 2 дней.
8. Распределите нити каждой агаровой пластины с помощью инокуляционной петли на несколько свежих бакто-агаровых пластин f/2^+, содержащих 120 мкг/мл канамицина. Выращивайте пластины при белом свете при температуре 25 °C и регулярно проверяйте культуры под микроскопом.
9. Определите живые, трансформированные нити через 7-28 дней под микроскопом. Ищите здоровые зеленые нити (Рисунок 1), которые отличаются от других нитей. Если эти зеленые нити могут быть идентифицированы, перейдите к следующему шагу; В противном случае держите тарелку еще 7 дней.
10. С помощью щипцов перенесите эти идентифицированные живые нити в 50 мл жидкой среды f/2⁺ с 250 мкг/мл канамицина. Культивируйте при белом свете при температуре 25 °C на вибростенде (горизонтальное вращение, 50 об/мин). Наблюдайте за ростом до четырех недель.
11. Перенесите нити обратно в агаровую среду, содержащую 250 мкг/мл канамицина, и подождите, пока нити вырастут. Через несколько дней перенесите одиночные нити в свежую агаровую пластину с более высокой концентрацией канамицина, например, 500 мкг/мл. Сохраните оригинальную табличку.
12. Убедитесь, что нити размножаются в высокой концентрации канамицина в жидкой культуре или на агаре. Снова увеличьте концентрацию канамицина, чтобы ускорить сегрегацию. ЗАМЕТКА: Трансформированный P. lacuna растет в канамицине до 10 000 мкг/мл. Другие виды могут не переносить такие высокие концентрации.
13. Для выражения GFP: наблюдайте за отдельными нитями с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении объектива в 40x или 63x. Захват светлопольного изображения пропускания и флуоресцентного изображения. Используйте следующие настройки для GFP: полоса пропускания 470 нм для возбуждения, полоса пропускания 525 нм для излучения и светоделитель 495 нм, начальное время экспозиции 500 мс.
14. Отрегулируйте время экспозиции для получения четких сигналов флуоресценции, избегая насыщения интенсивности. Старайтесь использовать одну и ту же настройку для всех образцов.
15. Поскольку нити дикого типа также будут демонстрировать флуоресценцию, делайте снимки с теми же настройками, что и выше, для этой фоновой флуоресценции.ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм, экспрессирующий GFP, должен иметь более высокий сигнал; в противном случае он не выражает GFP.
16. Основываясь на времени экспозиции и интенсивности пикселей флуоресцентных изображений, рассчитайте и сравните содержание GFP в различных нитях накаливания.

Результаты

Рисунок 1. Нити Phormidium lacuna через 5 недель после превращения. Использовался вектор экспрессии sfGFP pMH1; отбор осуществлялся на среде f/2 со 120 мкг/мл канамицина. Зеленоватые н...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бакто-агар	Отто Норвальд	214010
Флуоресцентный микроскоп ApoTome	Цейсс
Флуоресцентный микроскоп Axio Imager 2	Цейсс
Канамицин	Сигма-Олдрич	25389-94-0
Микроскоп DM750	Цейсс
Набор для экстракции плазмид NucleoBond Xtra Midi kit	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
Источник света, люминесцентная лампа L18W/954 дневной свет	Компания OSRAM		Выращивание цианобактерий
Источник света, светодиодная панель XL 6500K 140 Вт	Блум Стар	Н/Д	Выращивание цианобактерий
Чашки Петри из полистирола, 100 мм x 20 мм	Мерк	П5606-400ЭА
Чашки Петри из полистирола, 60 мм x 15 мм	Мерк	П5481-500ЭА
Pipetman 100-1 000 μл	Гилсон	Артикул: FA10006M
Пипетман 10-100 μл	Гилсон	Артикул: FA10004M
Пластиковые пипетки 10 мл, стерильные	Грейнер	607107
Шейкер Unimax 2010	Инструменты Heidolph		Для выращивания
Пластиковая пробирка, стерильная, 50 мл	Грейнер	227261
Бесшумная дробилка Ultraturrax M	Инструменты Heidolph		Гомогенизатор
Жидкая среда F/2+	f/2-средний, с 10-кратным увеличением NaNO₃ и₂PO₄ (0,88 мМ NaNO₃, 36 мкМ₂PO₄
F/2+-агар	3 % (v/v) бактоагар, искусственная морская вода, 0,1 % (v/v) раствор микроэлемента, 0,05 % (v/v) раствор витамина, 8,8 мМ NaNO₃, 0,36 мМ₂PO₄