Генерация меченых антибиотиками мутантов у цианобактерий путем гомологичной рекомбинации

Аннотация

Источник: Lea-Smith, D. J., et al. Генерация меченых и безмаркерных мутантов у модельных видов цианобактерий. J. Vis. Exp. (2016)

В видеоролике демонстрируется метод получения меченых антибиотиками мутантов у цианобактерий. Протокол начинается с культивирования цианобактерий, за которыми следуют этапы центрифугирования и промывки, которые сохраняют поверхностные пили. Затем вводится плазмида, несущая ген устойчивости к антибиотикам, окруженная гомологичными последовательностями. Во время инкубации плазмида интернализуется через пили и заменяет ген-мишень посредством гомологичной рекомбинации. Выбор антибиотиков и ретрикинг используются для выделения и очистки мутантного штамма.

Протокол

1. Приготовление питательных сред
   1. Приготовьте сине-зеленую среду 11 (среду BG11) по Кастенхольцу (1988).
      1. Приготовьте исходные растворы из 100x BG11, микроэлементов и железного сырья (Таблица 1).
      2. Приготовьте отдельные растворы фосфатного сырья, фосфора карбоната натрия (Na₂CO₃), буфера N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ТЭС) и бикарбоната натрия (NaHCO₃) (табл. 1).
      3. Автоклавирование запасов фосфатов и Na₂CO₃. Фильтр-стерилизующий буфер TES и NaHCO₃ с фильтрами 0,2 мкм.
      4. Приготовьте BG11, смешав 976 мл воды, 10 мл 100x BG11, 1 мл микроэлементов и 1 мл железного бульона, и автоклавируйте раствор. После того как этот раствор остынет до комнатной температуры, добавьте 1 мл фосфатного бульона, 1 мл бульона Na₂CO₃ и 10 мл NaHCO₃.
      5. Для твердой среды BG11 добавьте в одну колбу 15 г агара и 700 мл воды. Во вторую колбу добавьте 3 г тиосульфата натрия (Na₂S₂O₃), 226 мл воды, 10 мл 100x BG11, 1 мл микроэлементов и 1 мл железного бульона. Автоклавируйте оба раствора. После того как эти растворы остынут до комнатной температуры, соедините их и добавьте 1 мл фосфатного сырья, 1 мл запаса Na₂CO₃, 10 мл буфера TES и 10 мл NaHCO₃.
         ЗАМЕТКА: Растворы готовятся отдельно, чтобы избежать выпадения в осадок тех или иных солей.
2. Для выбора на сахарозе приготовьте 50% (по массе) раствору сахарозы. Фильтруйте раствор фильтрами 0,2 мкм и добавьте к BG11 (100 мл 50% сахарозы на 900 мл BG11) для получения BG11/5% сахарозных пластин.
   ЗАМЕТКА: Не добавляйте NaHCO₃ в пластины BG11/5% сахарозного агара. Добавьте Na₂CO₃ как обычно.
3. Для культивирования синехококка в 1 л среды BG11 добавить 10 мл 1 М 4-(2-гидроксиэтил)пиперазина-1-этансульфоновой кислоты, N-(2-гидроксиэтил)пиперазина-N'-(2-этансульфоновой кислоты) (HEPES) и 1 мл витамина B12 (табл. 1).
   ЗАМЕТКА: Трансформация штаммов, культивируемых в коммерчески доступных средах BG11, значительно менее эффективна, чем в описанных здесь рецептах сред BG11, и поэтому не рекомендуется.

Таблица 1: Решения, использованные в данном исследовании.

Рецепты стоковых растворов
Химический	Сумма (г)
100x BG11 (за л)
NaNO₃	149.6
MgSO₄·7H₂O	7.49
CaCl₂·2H₂O	3.6
Лимонная кислота	0.6
Добавьте 1,12 мл 0,25 М Na₂EDTA, pH 8,0
0,25 М Na₂EDTA, pH 8,0 (на 100 мл)
Na₂EDTA	9.3
Микроэлементы (на 100 мл)
Ч₃БО₃	0.286
MnCl₂·4H₂O	0.181
ZnSO₄·7H₂O	0.022
Na₂MoO₄·2H₂O	0.039
CuSO₄·5H₂O	0.008
Co(NO₃)₂·6H₂O	0.005
Железный бульон (на 100 мл)
Цитрат железа и аммония	1.11
Фосфатный бульон (на 100 мл)
К₂HPO₄	3.05
Запас Na2CO3 (на 100 мл)
Na₂CO₃	2
Буфер TES, pH 8,2 (на 100 мл)
ТЭС	22.9
Бульон NaHCO3 (на 100 мл)
NaHCO₃	8.4
HEPES, pH 8,2 (на 500 мл)
ХЕПЕС	119.15
Витамин B₁₂ (На 50 мл)
Цианокобаламин	0.02
Luria Bertani media (По 500 мл)
Бульон Luria Bertani	12.5
1 M MgCl₂ (на 100 мл)
MgCl₂·6H₂O	20.33
Раствор А (На 200 мл)
MnCl₂·4H₂O	0.395
CaCl₂·2H₂O	1.47
2-(N-морфолино)этаносульфоновый гидрат, 4-морфолинэтансульфоновая кислота (MES)	0.4265
Раствор А + глицерин
10 мл раствора А
1,5 мл глицерина

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Рост штаммов цианобактерий

1. Культуру процеживают в конические колбы по 100 мл с максимальным объемом 50 мл и встряхивают со скоростью 120 оборотов в минуту (об/мин). Заклейте пластины BG11 парапленкой и проколите три небольших отверстия в боковой части пластины, чтобы обеспечить газообмен. Инкубировать все штаммы при 30 °C под люминесцентными лампами в фотобиореакторе при интенсивности света 20-40 мкм фотонов м-2 сек-1.
2. Используйте лучшие стерильные методики. Обрабатывайте все штаммы цианобактерий в колпаке с ламинарным потоком.
   ЗАМЕТКА: Это особенно важно, когда штаммы культивируются в средах, содержащих сахарозу, которая может быть легко загрязнена.

3. Генерация плазмидных конструкций

1. Проектируйте наборы праймеров, включая необходимые сайты фермента рестрикции, с использованием программного обеспечения для разработки праймеров, такого как Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), для амплификации двух областей ~1 kb 5' и 3' интересующего гена. Обратитесь к последовательности генома видов цианобактерий с помощью Cyanobase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase). В таблице 2 приведены все используемые здесь грунтовки. При проектировании грунтовок учитывайте следующие факторы:
   1. Убедитесь, что амплифицированные области включают 5' и 3' области гена, который будет мутировать, например, рисунок 1.
   2. Не мутируйте межгенные области, чтобы избежать непреднамеренной мутации антисмысловых и некодирующих РНК.
   3. При выборе фланкирующих областей не включайте всю открытую рамку считывания соседних генов, так как экспрессия этих генов в Escherichia coli может препятствовать клонированию.
2. Амплифицируйте продукты методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием высокоточной ДНК-полимеразы в соответствии с инструкциями производителя.
   ЗАМЕТКА: По нашему опыту, этот фермент дает мало ошибок.
   1. Организуйте ПЦР-реакции объемом 50 мкл, содержащие высокоточный буфер (HF-буфер) и 0, 1,5 или 3 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Используйте 100 нг геномной ДНК на одну реакцию. Используйте программу, состоящую из начального этапа денатурации 98 °C в течение 30 секунд, 35 раундов при 98 °C в течение 10 секунд, 67 °C в течение 30 секунд, 72 °C в течение 30 секунд, а затем заключительного этапа удлинения до 72 °C в течение 5 минут. Обычно это дает стабильные продукты.
3. Проверьте продукты ПЦР и образцы, обработанные ферментами эндонуклеазы, на правильный размер с помощью гель-электрофореза. Принимайте 1% (v/v) агарозные гели, содержащие 0,02% (v/v) бромида этидия, в течение 45 минут при 100 В. ВНИМАНИЕ: Бромид этидии является потенциальным мутаген и должен работать с соответствующей защитой.
4. Очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Также используйте этот набор для очистки фрагментов плазмиды, в том числе кусочков, вырезанных из агарозных гелей. Elute очищает ДНК в 14 μл воды.
5. На этапах клонирования инкубировать реакционные смеси эндонуклеазы рестрикции при 37 °C в течение >1 ч в общем объеме 30 мкл в соответствии с инструкциями производителя.
6. Для стадий лигирования лигатируют фрагменты ДНК при комнатной температуре в течение >1 ч в общем объеме 20 мкл, содержащем 5 мкл очищенной расщепленной плазмиды, 12 мкл очищенной расщепленной вставки, 2 мкл буфера и 1 мкл лигазы.
7. Получить трансформантные клетки Escherichia coli DH5α по следующей методике.
   1. Вырастите культуру кишечной палочки за ночь в среде по 10 мл Luria Bertani (LB).
   2. Инокулируйте 400 мл LB в коническую колбу объемом 1 л, содержащую 6 мл 1 M MgCl₂ (Таблица 1) с 1 мл ночной культуры.
   3. Выращивайте культуру при 37 °C при 220 об/мин в течение примерно 4 часов или до тех пор, пока внешний диаметр не достигнет 0,4-0,6.
   4. Поместите клетки на лед на 1 час.
   5. Центрифуга при 2 800 × г в течение 10 мин до грануляторов при 4 °C.
   6. Надосадочную жидкость удалить и повторно суспендировать в 160 мл раствора А (табл. 1) и инкубировать на льду в течение 20 мин.
   7. Центрифуга при 2 800 × г в течение 10 мин до грануляторов при 4 °C.
   8. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать в 4 мл раствора А + глицерин (табл. 1).
   9. Приготовьте 50 μл аликвот, заморозьте в жидкости N2, храните при -80 °C.
   10. Смешайте 5 л смеси для лигирования с 50 мл компетентных клеток и инкубируйте в течение 1 часа на льду.
   11. Подвергнуть клетки тепловому шоку при температуре 42 °C в течение 90 сек с последующей инкубацией на льду в течение 2 мин.
   12. Добавьте 950 μл среды LB (Таблица 1) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 часа.
   13. Аликвоты 50 и 200 мкл на планшетах с соответствующим антибиотиком, либо ампициллином (100 мкг/мл), либо канамицином (30 мкг/мл).
       ОСТОРОЖНОСТЬ: Как канамицин, так и ампициллин токсичны, и с ними следует обращаться с соответствующей защитой.
   14. Соберите и инкубируйте одиночные колонии в 2 мл LB среды, инокулированной соответствующим антибиотиком.
8. Очистите все плазмиды с помощью набора для очистки плазмид miniprep в соответствии с инструкциями производителя.
9. Сгенерируйте плазмиды, в этом конкретном примере для нокаутирования генов cpcC1C2 , в соответствии со следующими шагами.
   1. Амплифицируйте 1012 пар оснований (.н.) 5'-фланкирующую область (левый фрагмент) с помощью праймеров cpcC1C2leftfor и cpcC1C2leftrev (см. шаг 3.2, табл. 2). Удалите небольшое количество частиц ПЦР-реакции и подтвердите, был ли продукт правильного размера амплифицирован с помощью гель-электрофореза (шаг 3.3). Переварите этот фрагмент и pUC19 с помощью XbaI и BamHI (шаг 3.5).
   2. Очистите оба препарата (шаг 3.4), лигатируйте (шаг 3.6), трансформируйте (шаг 3.7) и установите четыре жидкие культуры по 2 мл LB с ампициллином (100 мкг/мл) из отдельных колоний для очистки плазмид с помощью минипрепов (шаг 3.8).
   3. Проверьте введение фрагмента в pUC19 с помощью расщепления XbaI/BamHI и гель-электрофореза (шаг 3.3). Полосы 2660.о. и 1012.о. указывают на правильное введение вставки в плазмиду.
   4. Амплифицируйте 1016.о. 3' фланкирующую область (правый фрагмент) с помощью праймеров cpcC1C2rightfor и cpcC1C2rightrev (см. шаг 3.2, таблицу 2). Удалите небольшое количество частиц ПЦР-реакции и подтвердите, был ли продукт правильного размера амплифицирован с помощью гель-электрофореза (шаг 3.3). Расщепляем этот фрагмент и pUC19 с помощью SacI и EcoRI (шаг 3.5).
   5. Очистите оба препарата (шаг 3.4), лигатируйте (шаг 3.6), трансформируйте (шаг 3.7) и установите четыре жидкие культуры по 2 мл LB с ампициллином (100 мкг/мл) из отдельных колоний для очистки плазмид с помощью минипрепов (шаг 3.8).
   6. Проверьте введение фрагмента в pUC19 с помощью разложения SacI/EcoRI (шаг 3.5) и электрофореза гелем (шаг 3.3). Полосы 2660.о. и 1016.о. указывают на правильное введение вставки в плазмиду. ПРИМЕЧАНИЕ: Везде, где это возможно, используются сайты XbaI/BamHI для клонирования 5'-региона и SacI/EcoRI для клонирования 3'-области в pUC19. Если это возможно, всегда включайте сайт BamHI в обратную грунтовку для 5'-области или прямую грунтовку для 3'-области, чтобы гарантировать, что последующие этапы клонирования будут более легкими для выполнения.
   7. Секвенируйте обе вставки, чтобы определить правильность последовательности, используя праймеры, охватывающие место введения, например, M13 вперед и M13 обратно (табл. 2). Последовательность должна быть правильной, чтобы гарантировать отсутствие ошибок в фланговых областях.
   8. Иссекаем левый фрагмент из pUC19 с помощью разложения XbaI/BamHI. Перевариваем фрагмент pUC19 + правый с помощью XbaI/BamHI (шаг 3.5).
   9. Очистите левый фрагмент 1012.н. и 3676.н. pUC19 + правый фрагмент из агарозного геля (шаг 3.3) путем иссечения ДНК с помощью лезвия скальпеля.
   10. Очистите оба препарата (шаг 3.4), лигатируйте (шаг 3.6), преобразуйте (шаг 3.7) и установите четыре жидкие культуры по 2 мл LB с ампициллином (100 мкг/мл) из отдельных колоний для очистки плазмид с помощью минипрепов (шаг 3.8).
   11. Проверьте возможность введения фрагмента в pUC19 + правый фрагмент с помощью расщепления XbaI/BamHI (шаг 3.5) и гель-электрофореза (шаг 3.3). Полосы 3676.о. и 1012.о. указывают на правильное введение вставки в плазмиду (см. это как плазмида В).
   12. Удалите кассету с неомицина фосфотрансферазой/геном левансукразы (npt1/sacB) из pUM24cm19 с помощью расщепления BamHI. Расщепляют плазмиду B с помощью BamHI (шаг 3.5).
       ЗАМЕТКА: Кассету npt1/sacB не нужно очищать от агарозных гелей, поскольку pUM24cm кодирует белок, придающий устойчивость к хлорамфениколу. Поэтому, если колонии выращиваются на агаровых планшетах LB/ампициллин/канамицин, единственной возможной комбинацией, которая приведет к резистентным колониям, является включение кассеты npt1/sacB в плазмиду B.
   13. Очистите оба препарата (шаг 3.4), лигатируйте (шаг 3.6), трансформируйте (шаг 3.7) и установите четыре жидкие культуры по 2 мл LB с ампициллином (100 мкг/мл) и канамицином (30 мкг/мл) из отдельных колоний для очистки плазмид с помощью минипрепов (шаг 3.8).
   14. Проверьте возможность введения кассеты npt1/sacB в плазмиду B с помощью расщепления BamHI (шаг 3.5) и электрофореза геля (шаг 3.3). Полосы 4 688.н. и 3 894.о. указывают на правильное введение вставки в плазмиду (см. это как плазмида А).

Таблица 2: Праймеры, использованные в данном исследовании. Выделены сайты эндонуклеазы рестрикции.

Букварь	Последовательность
cpcC1C2leftfor	GTACTCTAGCGGCTAAATGCTACGAC
cpcC1C2leftrev	GATCGGATCCGCGGTAATTGTTCCCTTTGA
cpcC1C2rightfor	GATCGAGCTGCACTGGTCAGTCGTTC
cpcC1C2rightrev	GACTGAATTCATCGTTGCTGTGAACGGTC
М13 вперед	TGTAAAACGACGGCCAGT
М13 задний ход	CAGGAAACAGCTATGAC
cpcC1C2для	GTTTTCATTGGCATCGGTCT
cpcC1C2rev	ATGTCCCAGGAACGACTGAC
А1173для	AGCAAACCGTTTTTTTGACC
А1173rev	TGCAAGGTGGCGAACTGTAT

 

 

4. Генерация меченых мутантов Synechocystis и Synechococcus

1. Создайте свежую культуру, инокулировав петлю, полную клеток, в 30-50 мл среды BG11. Выращивайте культуру в течение 2-3 дней до оптической плотности на уровне 750 нанометров, или OD₇₅₀nm = от 0,2 до 0,6.
   ЗАМЕТКА: Как правило, отдельные колонии слишком малы для использования для инокуляции, и воздействие на отдельные клетки даже низких уровней света приведет к фотоингибированию и отбору светоустойчивых мутантов.
2. Центрифугируйте 1-2 мл культуры в дозе 2300 × г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Не центрифугируйте культуры цианобактерий при концентрации >2300 × г, так как это может повредить клетки. Промойте гранулу один раз средой BG11.
   ЗАМЕТКА: Не суспендируйте клетки путем вортексинга, так как это может привести к потере пили, которые необходимы для усвоения ДНК. Ресуспендируйте клетки с помощью щадящего пипетирования.
3. Добавьте среду BG11 до конечного объема 100 μл. Переложите ячейки в пробирку с круглым дном объемом 14 мл.
4. Добавьте в клетки 1 г плазмиды А и перемешайте легкими постукиваниями. Добавьте <10 мкл плазмиды.
   ЗАМЕТКА: Предпочтительно, чтобы плазмида была в концентрации >100 нг/мкл, но концентрации ниже этой величины достаточны для успешного превращения.
5. Уложите трубки горизонтально вниз в инкубатор. Инкубируйте культуры в течение 4-6 часов.
   ЗАМЕТКА: Клетки можно кратковременно перемешивать, постукивая каждые 1-2 часа, но это не обязательно. Образцы можно помещать в встряхивающий инкубатор, хотя это существенно не повышает эффективность.
6. Распределите аликвоты смеси клеточной культуры/плазмидной ДНК на агаровых планшетах BG11 без антибиотиков. Как правило, аликвоты объемом 20 мкл и 80 мкл распределяются по отдельным тарелкам.
7. Через ~24 часа добавьте в агаровую тарелку 2,5-3 мл 0,6% раствора агара в воду, содержащую канамицин (на 20 мл: 0,12 г агара, 100 мкл 100 мг/мл канамицина). Остудите этот раствор до ~42 °C и добавьте его к краю агаровой пластины. Наклоните пластину так, чтобы раствор образовал ровный слой «верхнего агара» на поверхности.
8. Инкубируйте агаровые пластины в течение дальнейшего периода времени. Колонии должны быть видны примерно через 7 дней.
   ЗАМЕТКА: Агаровые тарелки можно уложить в 3 раза в высоту в инкубаторе. Как правило, за одно преобразование получаются сотни колоний.
9. Разрежьте отдельные колонии на агаровых пластинах BG11 + канамицин (30 мкг/мл). Разделите пластину с агаром на 6 секторов и с помощью зубочистки с тупым концом прорежьте колонии над каждым сектором. Получение единичных колоний не важно; Как раз рост трансформеров есть.

Результаты

Рисунок 1: Плазмидная конструкция для генерации маркированных и немаркированных нокаутов, например, cpcC1 и cpcC2 в

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
NaNO₃	Сигма	С5506
MgSO₄·7H₂O	Сигма	230391
CaCl₂	Сигма	С1016
Лимонная кислота	Сигма	С0759
Na₂EDTA	Рыбак	ЭДТ002
Ч₃БО₃	Сигма	339067
MnCl₂·4H₂O	Сигма	М3634
ZnSO₄·7H₂O	Сигма	Телефон Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Сигма	331058
CuSO₄·5H₂O	Сигма	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Сигма	239267
Цитрат железа и аммония	Сигма	Ф5879
К₂HPO₄	Сигма	П3786
Na₂CO₃	Рыбак	SODC001
ТЭС	Сигма	Т1375
NaHCO₃	Рыбак	SODH001
ХЕПЕС	Сигма	Н3375
Цианокобаламин	Сигма	47869
Na₂S₂O₃	Сигма	72049
Бакто-агар	БД	214010
Сахароза	Рыбак	СУК001
Чашка Петри 90 мм тройная вентилируемая	Грейнер	633185
Фильтры 0,2 мкм	Сарториус	16534
Конические колбы 100 мл	Пирекс	КОН004
Парапленка М 100 мм х 38 м	Бемис	ФИЛ003
Высокоточная ДНК-полимераза phusion	Фьюзион	Ф-530
Агароза	Мелфорд	МБ1200
Набор для очистки ДНК	МоБио	12100-300
Эндонуклеазы рестрикции	КЛЮВ
Т4 лигаза	Термо Сайентиал	ЭЛ0011
Бульон Luria Bertani	Инвитроген	12795-027
МЧС	Сигма	М8250
Канамицина сульфат	Сигма	60615
Ампициллин	Сигма	А9518
Набор для мини-подготовки плазмид GeneJET	Термо Сайентиал	К0503
Туба с круглым дном 14 мл	BD сокол	352059
Глицерин	Сигма	Г5516
ДМСО	Сигма	Д8418