Образование бактериальных наноцеллюлозных пелликул, встроенных в магнитит

Аннотация

Источник: Ариас, С. Л. и др. Изготовление функционализированной магнитной бактериальной наноцеллюлозы с использованием наночастиц оксида железа. J. Vis. Exp . (2016)

В этом видео демонстрируется in situ синтез наночастиц магнетита внутри бактериального наноцеллюлозного пелликула, образуемого Gluconacetobacter xylinus. В ней объясняется, как магнитная бактериальная наноцеллюлоза образуется посредством инфузии ионов железа, щелочного осадка и очистки.

Протокол

1. Синтез наночастиц оксида железа с полимерным покрытием и их отложение в мембране бактериальной наноцеллюлозы (BNC)

1. Пузырьте 1000 мл высокочистой воды азотом, чтобы удалить растворённый кислород в воде, и заменить его азотом.
2. Используйте колбу с круглым дном с тремя шеями, чтобы приготовить раствор в молярном соотношении 2:1 из гексагидрат железа (III) хлорида (FeCl₃·_{6H 2}O) и тетрагидрата хлорида железа (II) (_{FeCl 2}·_{4H 2}O), разбавленных деоксигенированной водой высокой чистоты. Например, используйте 5,4 г FeCl₃·6H₂O и 1,98 г FeCl₂·4H₂O в 10 мл деоксигенированной воды высокой чистоты. Если препарат становится слишком вязким и трудно перемешивается, используйте 0,54 г FeCl₃·6H₂O и 0,198 г FeCl₂·4H₂O в 20 мл деоксигенированной воды высокой чистоты.
   ЗАМЕТКА: Сократите время воздействия FeCl₂·4H₂O, взвешивая это химическое соединение как можно быстрее. После установки в колбу с тремя горлышками и круглым дном закрывают трёхгорлышковую круглую дно с помощью пробок для перегородки, пока она не будет подключена к подаче азота и трубке конденсатора.
3. Используйте два горлышки сосуда для обеспечения постоянного входа и выхода азота, подключая подачу азота к игле, пробитой в пробке перегородки и закреплённой на шее сосуда.
4. Поместите 1 пелликлу BNC (диаметром 15,6 мм и толщиной 2-3 мм) вместе с реагентами. Убедитесь, что образец полностью погружен в жидкость.
5. Подключите оставшуюся часть сосуда к конденсаторной трубке. Кроме того, используйте сушильную трубку, наполненную безводным сульфатом кальция, поверх конденсаторной трубки. Пропустите воду через трубку конденсатора.
6. Запечатайте все стеклянные соединения вакуумной смазкой.
7. Нагрейте раствор в ванне с силиконовым маслом до 80 °C с помощью размешивающей плиты и задержите эту температуру до шага 1.10. Используйте небольшой магнитный перемешиватель для смешивания реагентов при 350 об/мин в течение 5 минут. Убедитесь, что BNC правильно пропитывается железным раствором, а реагенты полностью растворяются. Продолжайте перемешивать смесь до конца эксперимента.
   ЗАМЕТКА: Используйте термометр для проверки температуры силиконового масла. Температура должна оставаться стабильной до 80 °C.
8. Увеличьте скорость перемешивания до 700 об/мин и добавьте (капнув) за 5 минут 5 мл гидроксида аммония (_{NH 4}OH, 14%) к 10 мл железного раствора с помощью пипетной игли, которая также была пробита в пробке перегородки. После добавления гидроксида аммония цвет раствора меняется с жёлтого/оранжевого на чёрный.
9. Продолжайте мешивать раствор при 80 °C ещё 5 минут. Избегайте перемешивания на высокой скорости для сохранения целостности образца. Высокие скорости , то есть выше 1000 об/мин, могут разрушить образец.
10. Понижите температуру раствора до 30 °C, используя нижню часть горячей плиты и продолжайте мешать ещё 5 минут. Затем выключите плитку. На данный момент наночастицы оксида железа (IONP) включены в сетку BNC.
11. Охлаждайте смесь до комнатной температуры (RT) и разделяйте магнитные наночастицы (MNP) и BNC с помощью сильного постоянного магнита (например, 1 Tesla). Для этого смесь переведите в колбу сосуда, а затем, держа магнит близко к сосуду, удерживайте MNP и BNC на месте при декантировании супернатаната.
    Заметка: Будьте осторожны при работе с сильными магнитами, так как они могут быть вредны при неправильном использовании. Для шагов (1.12) - (1.14) и (1.16) используйте деоксигенированную воду высокой чистоты, ранее подготовленную в (1.1), чтобы предотвратить окисление частиц.
12. Повторно суспензируйте MNP и BNC в воде 100 мл. Аккуратно встряхните раствор, чтобы удалить все MNP, которые не сильно интегрированы в BNC. Снова декантуйте супернатант, удерживая MNP и BNC на месте с помощью магнита.
13. Промывайте MNP и BNC несколько раз водой, пока супернатант не достигнет нейтрального pH (pH~7), измеренного с помощью колориметрической полоски.
14. Отделите магнитно-функционализированную BNC или магнитно-бактериальную наноцеллюлозу (MBNC) от MNP с помощью пинцета и несколько раз промывайте MBNC водой, пока вода не станет прозрачной.
15. Стерилизуйте MBNC, подвергая O/N MBNC воздействию ультрафиолета (110-280 нм).
16. Автоклав 500 мл деоксигенированной воды высокой чистоты при 120 °C в течение 20 минут и храните MBNC в 20 мл этой воды.
17. Асептически погрузите образец в 1% полиэтиленгликоля (ПЭГ) и перемешайте 2 часа при RT (37 °C). Эта процедура улучшает биосовместимость и стабильность наночастиц оксида железа, отложенных в BNC, особенно тех, что обнажаются на поверхности. Покрытие PEG будет распространяться по сети MBNC 3D.
    ЗАМЕТКА: Голые ИОНП легко окисляются в воздухе благодаря высокой химической активности. Хотя ПЭГ считается небиоразлагаемым материалом, его химическая стабильность зависит от применяемых биологических условий, таких как содержание воды, pH, температура, наличие ферментов, реактивные виды кислорода, реактивные виды азота и другие.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Гексагидрат хлорида железа(III)	Сигма Олдрич	236489-100G
Гидроксид аммония	Macron Fine Chemicals	6665-46
Поли(этиленгликоль), средний Mn 400	Сигма Олдрич	202398-250G
Тетрагидрат хлорида железа (II)	Сигма Олдрич	44939-250G
Безводный сульфат кальция	У.А. Хаммонд Дриерит	13001
Высоковакуумная смазка	Сигма Олдрич	Z273554-1EA
pH-тест-полоски	Сигма Олдрич	P4786-100EA
Дистилляционная колба с круглым дном и тремя угловыми углами	Сигма-Олдрич	CLS4965250
Силиконовое масло для масляных ванн	Сигма-Олдрич	85409-250ML
Сушильная трубка	Chemglass	CG-1295-01
Пробка перегородки, тип рукава	Chemglass	CG-3022-98
Магнитная перемешивающая планка	Chemglass	CG-2001-05
Конденсатор	Chemglass	CG-1218-01
Регулятор температуры	BriskHeat	SDC120JC-A
Размешивающая плитка	Fisher Scientific	11-100-49SH