Высокопроизводительный флуоресцентный анализ для изучения взаимодействия микроорганизмов и червей

Аннотация

Источник: Али, И. и др. Высокопроизводительный скрининг микробных изолятов с влиянием на здоровье Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp . (2022)

В этом видео демонстрируется высококачественный флуоресцентный анализ для оценки того, как бактерии кишечника влияют на стрессоустойчивость у Caenorhabditis elegans. Отслеживая синюю флуоресценцию из разорванных кишечных гранул, анализ выявляет более ранние сигналы смерти у червей, подвергшихся эксперименту бактериям.

Протокол

1. Безметок Caenorhabditis elegans (C. elegans), оценка выживаемости (LFASS), тепловой шок и установка окислительного анализа (13–14 дней)

1. Оцените стадию развития червей. Когда >90% червей достигнут L4, соберите их в до 10 мл стерильного раствора M9 в конических трубках по 15 мл.
2. Тщательно промывайте червей (не менее 4 раза), отжимая при 142xг на 2 минуты при 4 °C, удаляйте супернатант и добавляя 10 мл свежего стерильного M9 между каждыми стирками, чтобы избавиться от бактерий Escherichia coli OP50. Подвесьте червячную гранулу в 10 мл M9.
3. Пересадите 50 мкл червячного раствора в низкоповерхностную связывающую трубку с 950 мкл M9. После аккуратного смешивания содержимого трубки для предотвращения осадконакопления червями быстро используйте увлажнённый кончик пипетки с низким уровнем связывания, чтобы перенесите 3-4 отдельные капли по 10 мкл на стеклянную стекло или пластину для среды роста нематод (NGM). Считать количество червей под стереомикроскопом при увеличении в 16 раз. Усредняйте количество из 3-4 капель и определите количество червей на микролитр в растворе для червя.
4. Отрегулируйте концентрацию червя в трубке на 10 мл, чтобы достичь ~120 червей в 8 мкл. Если решение подготовлено в шаге 1.2. недостаточно концентрирована, прокрутите червей вниз и удалите M9, чтобы достичь 120 червей на 8 мкл.
5. Перелите 8 мкл червячного раствора (~120 червей) в каждую из колодец восьми 96-колодных NGM-агарозных пластин, подготовленных заранее, используя многоканальную или повторную пипетку. Обязательно используйте насадки с низким уровнем удержания, чтобы минимизировать потерю червей. Также может понадобиться обрезание кончиков, чтобы крупные взрослые черви могли снизить механическую нагрузку на них.
   ЗАМЕТКА: Для надёжной работы анализу требуется минимум 30 живых здоровых червей, но лучше всего работает примерно со 100 червями на колодцу.
6. Инкубировать 96-колодящие NGM-агарозные пластины с червями и бактериями при 25 °C в течение 36 часов.
7. Проверьте пластины между 12 и 24 часами, убедитесь, что червей остаётся полным на протяжении всего времени. Если требуется повторное кормление, повторно суспендуйте бактерии внутри 96-луночной бактериальной массива, хранящейся при 15 °C, и добавьте до 10 мкл соответствующего бактериального раствора к 96-луночным NGM-агарозным пластинам, где черви находятся под угрозой голодания до конца 36-часового инкубационного периода (голодающие черви дадут совершенно разные результаты, Так что это очень важно).
   ЗАМЕТКА: Следующие шаги необходимо выполнить на 15-й день. Перед началом анализа может потребоваться оптимизировать высоту измерения. Оптимальное измерение будет достигнуто на высоте 20-50 мкм выше дна скважины. Это зависит от модели считывателя пластин. Некоторые предлагают возможность Z-сканирования, другие позволяют вручную вводить высоту. Установите оптимальную высоту на уровне, где фиксируется самый высокий сигнал синего флуоресценции (365 нм/430 нм). Некоторые считыватели пластин могут работать на фиксированной высоте, оптимизированной для анализов клеток клеток, и могут быть неподходящими для LFASS-анализов.
8. Через 36 часов впустите по 30 мкл M9 в каждую скважину пластины с 96 лунками.
   ЗАМЕТКА: Для теста на термические напряжения считыватель пластин должен достичь необходимой температуры для проведения анализа и, возможно, заранее включить. Текущий протокол использует 42 °C для максимизации скорости уничтожения, но этот подход применяется к другим температурам выше 30 °C.
9. Перенесите червей (около 20 мкл) на пластину с 384 лунками согласно установленным наконечникам, используя наконечники с низким уровнем удержания (рассмотрите возможность отрезать конец кончиков, чтобы крупные черви могли уменьшить механические нагрузки для взрослых червей).
   ЗАМЕТКА: Для настоящего исследования используются две разные настройки считывателя пластин для двух описанных здесь анализов (тепловое напряжение и окислительное напряжение), поэтому образцы, предназначенные для этих двух анализов, не должны быть покрыты одной и той же пластиной с 384 лунками.
10. Убедитесь, что считыватели пластин настроены правильно (Таблица 1).
11. Добавьте пластины с 384 лунками дополнительным объемом M9, стремясь к итоговому объёму 60 мкл на каждую скважину. Для теста на термический стресс добавьте 40 мкл M9, а для окислительного стресса, индуцированного тертбутилгидропероксидом (t-BHP), 34 мкл M9 в 6 мкл t-BHP.
    1. Начинайте анализ в течение 2 минут после добавления t-BHP (в идеале, чтобы все черви одновременно подвергались воздействию t-BHP, разрешение по времени анализа составляет 2 минуты). Если это невозможно, используйте таймер для оценки времени, затраченного на пипетирование t-BHP перед началом анализа, чтобы позже скорректировать медианное время смерти.
12. Закройте тарелки прозрачной крышкой. Запечатайте края пластин с 384 лунками малярной лентой (заклеивая пластину и крышку), чтобы лента не закрывалась на крышку или под пластину. Разрезать ленту между крышкой и пластиной с интервалами с помощью скальпеля, чтобы обеспечить обмен воздухом и минимизировать испарение во время анализа.
13. Вставьте пластину в считыватель пластин и начните запуск. Стремитесь к возбуждению на 365 нм и обнаружении излучения на 435 нм каждые 2 минуты в течение 6-12 часов (Таблица 1).
    ЗАМЕТКА: Обычно 6 часов достаточно для тестов теплового стресса 42 °C, а 8 часов — для 7% t-BHP окислительного стресса.

Таблица 1: Настройки окислительного и теплового стресса. Примеры условий, используемых для окислительных (A) и тепловых (B) стрессовых тестов на считывателях флуоресцентных пластин, использованных в этом исследовании.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чёрные, прозрачные плоские пластины с плоским дном с 384-колодцем	Корнинг	3712 или 3762	Не обязательно быть стерильным для быстрых стресс-тестов
Прозрачные пластины на 96 лунок (Biolite)	Термо	130188
Агароза	Fisher Scientific	BP1356
Советы по LoBind	VWR	732-1488	Lo-bind снижает потерю червя во время переноса
Трубки LoBind	Эппендорф	22431081
Считыватель пластин — бесконечный M nano+	Текан		Монохроматорная установка позволяет настраивать флуоресцентную настройку, но могут использоваться подходящие фильтры
Считыватель номеров — Искра	Текан
Система стереомикроскопа с трансосветительным основанием	Leica	MZ6 или M80	Требуется увеличение от 0,6-0,8x до 40-60x, а также качественная основа трансосвещения с деформируемым, титируемым или сдвижным зеркалом для регулировки контраста
t-BHP (трет-бутилгидропероксид)	Сигма-Олдрич	458139
Прозрачные клеевые герметизации Nunc	Fisher Scientific	101706871	Важно, чтобы он был прозрачным и способен выдерживать температуры, связанные с анализами.