Экстракция апопластических бактерий с помощью метода давления на основе шприца

Аннотация

Источник: Руфиан, Ж. С. и др., Одноклеточный анализ экспрессии генов сирингов Pseudomonas в ткани растений. J. Vis. Exp . (2022)

В этом видео демонстрируется метод давления на основе шприца для извлечения апопластических бактерий, которые размножаются и образуют микроколонии внутри апопласта — межклеточного пространства между растительными клетками. Метод позволяет получить образцы бактерий без мусора, подходящие для дальнейшего одноклеточного анализа.

Протокол

Извлечение бактерий из апопласта

1. Через четыре дня после инокуляции отрежьте либо воздушную часть растения Arabidopsis , либо инокуленный лист от фасоли и поместите его в шприц объёмом 20 мл без иглы (рисунок 2G). Для листьев бобов свернуть лист на саму себе, оставив абаксиальную грань наружу, как показано на рисунке 2F.
2. Добавьте достаточно дистиллированной воды, чтобы покрыть ткань (обычно 10-15 мл).
3. Вставьте поршень и, держа шприц в вертикальном положении с наконечником вверх, удалите лишний воздух и пузырьки внутри шприца, аккуратно постукивая по стволу, пока весь воздух не окажется рядом с кончиком. Сдвините вантуз, чтобы вывести воздух. Когда внутри шприца будет как можно меньше воздуха, накройте кончик ствола керофиновой пленкой.
4. Аккуратно нажимайте на поршень, чтобы создать положительное давление, пока ткань не потемнеет (Рисунок 1I и Рисунок 2H). Затем потянут поршень, чтобы создать отрицательное давление (рисунок 1J и рисунок 2I). Повторите этот шаг 3-5 раз.
5. Удалите парафиновую пленку и поршень, а также соберите жидкость с бактериями, извлеченными из апопласта, как на рисунке 2J.

Результаты

Рисунок 1: Бактериальная инокуляция и экстракция апопласта с использованием растений Arabidopsis . (A) Подготовка горшка, правильно прикреплённая металлической сеткой. (B)

Материалы