Метод аффинитной хроматографии для очистки рекомбинантного бактериального белка

Аннотация

Источник: Becker, B. и др. Простой репортерный анализ на основе флуоресценции для выявления клеточных компонентов, необходимых для цепочного трафика токсина рицина (RTA) в дрожжах. J. Vis. Exp . (2017).

В этом видео демонстрируется очистка полигистидин-метированного рекомбинантного белка с помощью никелевой аффинной хроматографии. В нём описываются ключевые этапы, включая бактериальный лизис с помощью соникации, очистку и фильтрацию лизата, а также селективное связывание и элюжию целевого белка с помощью имидазола.

Протокол

1. Очистка РТА с его меткой с помощью аффинитной хроматографии

1. Сониковать клетки на льду по следующему протоколу: 15 с импульс (20 микрон), 30 с пауза. Повторите этот шаг пять раз.
2. Центрифугу лизировать клетки при 21 000 г и 4 °C в течение 15 минут и фильтровать супернатант с помощью стерильной системы фильтрации шприца (размер пор 0,2 мкм).
   ЗАМЕТКА: Клеточные гранулы успешно соникированных образцов имеют прозрачные границы.
3. Используйте автоматизированную систему очистки с 5 мл Ni 2+ на основе афинитета для очистки фракции RTA с меткой His, из стерильно фильтрованного супернатанта E. coli. В целом используйте скорость разрядки 1 мл/мин и охлаждайте всю систему очистки, чтобы предотвратить неэффективное связывание токсинов и их потерю.
   ЗАМЕТКА: Параметры эффективной очистки РТА приведены в Таблице 1.
   1. Кратко уравновесьте столбец аффинности с 20 мл буфера связывания, чтобы убрать буфер хранения. Нанесите стерильно-фильтрованный супернатант на колонку аффинности с помощью шприца.
   2. Промыйте колонку 25-35 мл связывающего буфера, чтобы удалить несвязанные белки из колонки. Выполняйте этап промывки, пока поглощение УФ-излучения при 280 нм не приблизится к начальному значению УФ.
   3. Элюируйте связанную фракцию RTA в 20-35 мл буфера элюции (500 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 20 мМ KH₂PO₄, pH = 7,2) и храните образец на льду (рисунок 1A и рисунок 1B).
      ЗАМЕТКА: Элюция РТА характеризуется увеличением поглощения УФ-излучения. Обратите внимание на сбор этой фракции исключительно, чтобы предотвратить загрязнение неспецифическими белками.

Таблица 1: Параметры, используемые для очистки и обезсоления на основе столбцов по аффинности. Список всех соответствующих настроек столбцов (например, расход, концентрация буфера элюирования, уравновесение и длительность шага промывки) и измеренные параметры (например, проводимость или поглощение ультрафиолета).

Параметр аффинной хроматографии
Параметры измерения	УФ (280 нм), концентрация буфера элюции, проводимость
Параметры	Переменная/Единица	Ценность
Расход	мл/мин	1
Максимальное давление в колонке	Мпа	0.35
Длина волны	Нм	280 нм
Буфер связывания	Положение насоса	A
Буфер элюции	Положение насоса	B
Начальный буфер элюирования концентрации	%	0
Компенсация объёма системы	мл	10
Уравновесление столбцов	мл	20
Инъекция образца через суперпетлю/шприц	мл	Объём лизата клеток
Шаг стирки	мл	20-35
Шаг элюции	мл	20-35
Буфер элюции концентрации во время элюции	%	100
Перекалибровка столбца с 20% EtOH	мл	50
Параметр обезсоли
Параметры измерения	УФ (280 нм), проводимость
Параметры	Переменная/Единица	Ценность
Расход	мл/мин	4
Максимальное давление в колонке	Мпа	0.35
Длина волны	Нм	280 нм
Буфер связывания	Положение насоса	A
Буфер элюции	Положение насоса	B
Начальный буфер элюирования концентрации	%	0
Компенсация объёма системы	мл	10
Уравновесление столбцов	мл	20
Инъекция образца через суперпетлю/шприц	мл	Объём лизата клеток
Инжекция буфера для обезсоли (0,8 м сорбитола)	мл	100
Перекалибровка столбца с 20% EtOH	мл	50

Результаты

Рисунок 1: Результаты репрезентативной аффинной хроматографии и десолизации клеток E. coli, содержащих pET-RTA_(His)6 или пустой контрольный вектор.(A) Типичный график очистки образца лиз...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Спектрофотометр Ultrospec 2100 pro	Амершем
Soniprep 150	MSE		Старая модель, доступны другие модели
Флуороскан Восхождение	Thermo Scientific	5210470	Старая модель, больше недоступна
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Продукт был снят с производства и заменён
Колонка HP HisTRAP	GE Healthcare	17-5248-02
Колонка для очистки соли HiTRAP	GE Healthcare	11-0003-29
Стерильный фильтр Midisart	Сарториус	16534K	Поровый размер 0,2 мкм
Белковый тест BCA	Прокалывать	23225
Набор для анализа 660 нм	Thermo Scientific	22660
96 скважинных пластин	Thermo Scientific	260860