Метод аффинитной хроматографии для очистки рекомбинантного бактериального белка

Аннотация

Источник: Becker, B. и др. Простой репортерный анализ на основе флуоресценции для выявления клеточных компонентов, необходимых для цепочного трафика токсина рицина (RTA) в дрожжах. J. Vis. Exp . (2017).

В этом видео демонстрируется очистка полигистидин-метированного рекомбинантного белка с помощью никелевой аффинной хроматографии. В нём описываются ключевые этапы, включая бактериальный лизис с помощью соникации, очистку и фильтрацию лизата, а также селективное связывание и элюжию целевого белка с помощью имидазола.

Протокол

1. Очистка РТА с его меткой с помощью аффинитной хроматографии

1. Сониковать клетки на льду по следующему протоколу: 15 с импульс (20 микрон), 30 с пауза. Повторите этот шаг пять раз.
2. Центрифугу лизировать клетки при 21 000 г и 4 °C в течение 15 минут и фильтровать супернатант с помощью стерильной системы фильтрации шприца (размер пор 0,2 мкм).
   ЗАМЕТКА: Клеточные гранулы успешно соникированных образцов имеют прозрачные границы.
3. Используйте автоматизированную систему очистки с 5 мл Ni 2+ на основе афинитета для очистки фракции RTA с меткой His, из стерильно фильтрованного супернатанта E. coli. В целом используйте скорость разрядки 1 мл/мин и охлаждайте всю систему очистки, чтобы предотвратить неэффективное связывание токсинов и их потерю.
   ЗАМЕТКА: Параметры эффективной очистки РТА приведены в Таблице 1.
   1. Кратко уравновесьте столбец аффинности с 20 мл буфера связывания, чтобы убрать буфер хранения. Нанесите стерильно-фильтрованный супернатант на колонку аффинности с помощью шприца.
   2. Промыйте колонку 25-35 мл связывающего буфера, чтобы удалить несвязанные белки из колонки. Выполняйте этап промывки, пока поглощение УФ-излучения при 280 нм не приблизится к начальному значению УФ.
   3. Элюируйте связанную фракцию RTA в 20-35 мл буфера элюции (500 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 20 мМ KH₂PO₄, pH = 7,2) и храните образец на льду (рисунок 1A и рисунок 1B).
      ЗАМЕТКА: Элюция РТА характеризуется увеличением поглощения УФ-излучения. Обратите внимание на сбор этой фракции исключительно, чтобы предотвратить загрязнение неспецифическими белками.

Таблица 1: Параметры, используемые для очистки и обезсоления на основе столбцов по аффинности. Список всех соответствующих настроек столбцов (например, расход, концентрация буфера элюирования, уравновесение и длительность шага промывки) и измеренные параметры (например, проводимость или поглощение ультрафиолета).

Параметр аффинной хроматографии
Параметры измерения	УФ (280 нм), концентрация буфера элюции, проводимость
Параметры	Переменная/Единица	Ценность
Расход	мл/мин	1
Максимальное давление в колонке	Мпа	0.35
Длина волны	Нм	280 нм
Буфер связывания	Положение насоса	A
Буфер элюции	Положение насоса	B
Начальный буфер элюирования концентрации	%	0
Компенсация объёма системы	мл	10
Уравновесление столбцов	мл	20
Инъекция образца через суперпетлю/шприц	мл	Объём лизата клеток
Шаг стирки	мл	20-35
Шаг элюции	мл	20-35
Буфер элюции концентрации во время элюции	%	100
Перекалибровка столбца с 20% EtOH	мл	50
Параметр обезсоли
Параметры измерения	УФ (280 нм), проводимость
Параметры	Переменная/Единица	Ценность
Расход	мл/мин	4
Максимальное давление в колонке	Мпа	0.35
Длина волны	Нм	280 нм
Буфер связывания	Положение насоса	A
Буфер элюции	Положение насоса	B
Начальный буфер элюирования концентрации	%	0
Компенсация объёма системы	мл	10
Уравновесление столбцов	мл	20
Инъекция образца через суперпетлю/шприц	мл	Объём лизата клеток
Инжекция буфера для обезсоли (0,8 м сорбитола)	мл	100
Перекалибровка столбца с 20% EtOH	мл	50

Результаты

Рисунок 1: Результаты репрезентативной аффинной хроматографии и десолизации клеток E. coli, содержащих pET-RTA_(His)6 или пустой контрольный вектор.(A) Типичный график очистки образца лиз...

Материалы