Подготовка бактериальных наноцеллюлозных пелликул из бактерий, производящих целлюлозу

Аннотация

Источник: Ариас, С. Л. и др. Изготовление функционализированной магнитной бактериальной наноцеллюлозы с использованием наночастиц оксида железа. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео демонстрируется производство наноцеллюлозы путём культивирования бактерий, производящих целлюлозу, в питательной среде, содержащей маннитол. Бактерии метаболизируют маннитол в глюкозу, которая затем полимеризуется и экструдируется в виде цепей глюкана, кристаллизующихся в слои целлюлозы, образуя трёхмерную матрицу на границе воздух–жидкость. Полученные желеобразные пелликулы собираются, очищаются щелочными и водяными промывками, а затем стерилизуются автоклавированием для дальнейших применений.

Протокол

1. Подготовка бактериальной наноцеллюлозы (BNC)

Заметка: Все этапы выполняются в асептических условиях, если не указано иное.

1. Подготовьте культурную среду.
   1. Приготовьте 500 мл жидкой культурной среды, смешав 25 г дрожжевого экстракта, 15 г пептона, 125,0 г маннитола и 500 мл воды высокой чистоты. Автоклавировать эту смесь при 120 °C в течение 20 минут и хранить при 4 °C.
   2. Приготовьте 100 мл полутвердой среды, добавив 15 г агар к 5,0 г дрожжевого экстракта, 3,0 г пептона, 25,0 г маннитола и 100 мл воды высокой чистоты. Автоклав этой смеси при 120 °C в течение 20 минут. После автоклава отложите 5 мл смеси в пластиковую чашу Петри размером 90 мм x 16 мм. Дайте раствору застыть при 4 °C и храните при этой температуре до дальнейшего использования.
2. Регидратировать штамм Glucoacetobacter xylinus (G. xylinus ), консервируемый в сублимированных флаконах путём добавления 1 мл жидкой культурной среды и пипета вверх и вниз, как указано в инструкциях производителя.
3. Инокуляция чашек Петри с полутвердыми материалами небольшими каплями бактериальной суспензии с помощью инокуляционной петли. Убедитесь, что инокулум покрывает всю чашку Петри, двигая петлю зигзагом от края к центру тарелки.
4. Инкубировать чашки Петри при 26 °C в течение 72 часов в инкубаторе без CO2. После завершения инкубационного периода появляются небольшие белые колонии. Если колонии не используются сразу, храните чашки Петри при 4 °C, закрывая крышку парапленкой и ставя её вверх ногами. Колонии можно хранить таким образом до 6 месяцев.
5. Переложите 2 мл жидкой культурной среды в каждую яме 24-колодцевой пластины для культуры тканей. Возьмите две колонии с иглой для инокуляции из инокуляционных чашек Петри и поместите их в первую яме пластины для культуры тканей. Повторите ту же процедуру для оставшихся 23 скважин.
6. Инкубировать пластину для культуры тканей при 30 °C в течение 7 дней. В итоге получится 24 BNC пелликулы диаметром 16 мм и толщиной примерно 2-3 мм, как показано на рисунке 1. Заметка: Не нарушайте бактериальную культуру ни в какой момент инкубационного периода, например, встряхивая пластины. В инкубационном периоде G. xylinus экструдирует молекулы глюкозиранозного сахара, образуя полимерную кристаллическую сетку на границе воздух-жидкость, которая при статических условиях культивации принимает форму и размер колбы. Эта полимерная матрица, известная как бактериальная наноцеллюлоза (BNC), заметна в конце инкубационного периода.
7. Соберите пелликулы BNC из ростовой среды и стерилизуйте их в 200 мл раствора NaOH 1% в течение 1 часа при 50 °C, чтобы удалить все следы G. xylinus. По желанию размешивайте этот раствор со скоростью 300 об/мин с помощью магнитной планки и перемешивающей пластины. Сбросьте раствор NaOH и добавьте 200 мл свежеприготовленного раствора NaOH 1%. Повторите тот же процесс ещё раз или пока пелликулы BNC в растворе не приобретут полупрозрачный вид.
8. Промыйте пелликулы BNC водой три раза и храните их в воде с высокой чистотой в RT. Убедитесь, что пелликулы BNC полностью погружены в воду и не могут высохнуть в любое время.
9. Автоклав пеликул BNC при 121 °C в течение 20 минут. Примечание: Подкожное исследование in vivo у крысы, проведённое Мэрцсоном и коллегами, не выявило признаков деградации BNC спустя 60 недель имплантации. Действительно, BNC по своей природе разлагается микробными и грибковыми ферментами, которые отсутствуют у млекопитающих. С другой стороны, биоразлагаемость BNC может быть результатом механических, химических и биологических процессов, которые ослабляют микрофибрильную сеть in vivo.

Результаты

Рисунок 1. Макроскопические аспекты бактериальной наноцеллюлозы. BNC пелликулы получены после 11-дневного инкубационного периода, что примерно соответствует результату. Толщина 3 мм. Инкубационный период зависит от требований к предпола...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Агар	Сигма Олдрич	A1296-500G
D-Mannitol Bioxtra	Сигма Олдрич	M9546-250G
Дрожжевый экстракт	BD Biosciences	212750
Бактериологический пептон	Сигма Олдрич	P0556
Гидроксид натрия, 50% раствор в воде	Сигма Олдрич	158127-100G