Выделение эндоспор из образца окружающей среды путём целевого лизиса вегетативных клеток

Аннотация

Источник: Wunderlin, T. и др. Физическая изоляция эндоспор из образцов окружающей среды путём целенаправленного лизиса вегетативных клеток. J. Vis. Exp . (2016)

В этом видео демонстрируется метод выделения эндоспор из образца окружающей среды, содержащего как вегетативные клетки, так и различные бактерии. Процедура включает фильтрацию, механические нарушения и селективную химическую обработку для ослабления и лизации растительных клеток при сохранении эндоспор. Последний этап — изоляция устойчивых эндоспор с помощью мембранной фильтрации.

Протокол

1. Подготовка химикатов и оборудования

1. Произведите 500 мл _{раствора} 1% гексаметафосфата натрия (SHMP) (_{NaPO 3})n и стерилизуйте с помощью автоклава.

2. Стерилизовать нитроцеллюлозные (NC) фильтры (поровый размер 0,22 мкм, диаметр 47 мм) путём автоклава в закрытых стеклянных чашках Петри.

3. Стерилизовать NC-фильтры (поровый размер 0,22 мкм, диаметр 25 мм) путём автоклавирования в закрытых стеклянных чашках Петри.

4. Взвесьте и обратите внимание на пустой вес стерильных пробирок объёмом 50 мл (с крышкой) (одна пробирка на образец).

5. Приготовьте буфер Tris-EDTA (TE-buffer) 1 раз: приготовьте раствор из буфера 10 мМ Трис (трис(гидроксиметил)аминометан) и 1 мМ буфера ЭДТА. Отрегулируйте pH до 8 и стерилизуйте с помощью автоклава.

6. Приготовьте раствор лизозима (20 мг/мл), растворив 0,02 г лизозима в 1 мл TE-буфера. В идеале — каждый раз делать его свежим. Храните при 4 °C не более 1 недели.

7. Приготовьте физиологический раствор, растворив 8 г/л хлорида натрия (NaCl) в дистиллированной воде. Стерилизуйте с помощью автоклавирования.

2. Отделение биомассы от осадков

1. Добавьте 3 г образца осадка в предварительно взвешенные стерильные пробирки объёмом 50 мл с использованием металлических заборов с этанолом. Выполняйте это в чистом шкафу с ультрафиолетовой стерилизацией, чтобы избежать загрязнения.

2. Добавьте 15 мл 1% стерильного (автоклавированного) раствора SHMP в образец с помощью стерильной градуированной бюреты. Раствор SHMP также можно фильтровать для предотвращения загрязнения.

3. Гомогенизировать осадки и раствор SHMP с помощью жидкого дисперсера/гомогенизатора (например, гомогенизатора Ultra-Turrax). 70% этанолом стерилизует или автоклавирует дисперсионный ротор перед использованием. Запустите гомогенизацию в течение 1 минуты при 17 500 об/мин. Дайте образцу отдохнуть 2 минуты и повторите гомогенизацию в течение 1 минуты при той же скорости ротора.

4. Дайте образцу постоять 10 минут. На этом этапе самые тяжёлые частицы (минералы) оседают. Однако клетки и любые органические компоненты образца останутся в растворе. Затем переместите супернатантный раствор (содержащий биомассу клеток) в чистую пробирку объёмом 50 мл, при этом стараясь не нарушать осадочные гранулы.

5. К осадочной грануле снова добавьте 15 мл 1% стерильного (автоклавированного) раствора SHMP с использованием стерильной градуированной бюретки. Затем повторяйте шаги 2.3 и 2.4. Это повторение обеспечивает отделение максимального количества клеток и органических частиц от минеральной составляющей осадка. Супернатант этого второго разделения может быть объединён с наднататым первого разделения.

Заметка: Все следующие шаги выполняются на супернатанте (содержащем биомассу клеток). Минеральный компонент (осадочные гранулы) можно отбрасывать.

6. Центрифугуйте образец при 20 x g в течение 1 минуты. Этот этап увеличивает g-силу настолько, чтобы оседать мелкие минеральные частицы, пока биологический клеточный материал остаётся в растворе. После центрифугирования переведите супернатантный раствор (содержащий биомассу клеток) в чистую пробирку объемом 50 мл. Выбросьте минеральную гранулу.

7. Определить окончательный объём раствора с биомассой, взвешивая образец. Определение веса позволяет избежать необходимости перемещать образец в градуированный цилиндр и снижает риск загрязнения.

3. Сбор биомассы на фильтрующей мембране

1. Подготовьте фильтрационный блок (для мембран диаметром 47 мм) и вакуумный насос. Стерилизуйте фильтрационный блок либо автоклавированием, либо (если это стекло Pyrex), опрыскивая его 70% этанолом и поджигая горелкой Бунзена. Дайте остыть, прежде чем продолжать процедуру.

2. Добавьте стерильную NC-мембрану к фильтрационному блоку с помощью стерилизованных щипцов с этанолом.

3. Добавьте половину супернатантного образца (начиная с шага 2.6) в мембранный фильтрационный блок и собирайте клетки на мембране с помощью вакуумного насоса.

4. Когда жидкость полностью пройдет через фильтр, остановить вакуумный насос и аккуратно снять мембрану с помощью щипцов, стерилизованных пламенем этанола. Поместите мембрану в стерильную чашу Петри.

1. Разрежьте мембрану пополам с помощью стерилизованных ножниц с этанолом. Добавьте каждую половину мембраны в отдельную трубку объемом 2 мл. Половина мембраны будет использована для экстракции ДНК и анализа всего бактериального сообщества. Вторая половина фильтра хранится при -80 °C и служит резервным.

5. Установите новую мембрану NC на фильтрационный блок и собирайте биомассу из второй половины объёма образца (начиная с шага 2.6) с помощью вакуумного насоса.

6. Когда жидкость полностью пройдёт через фильтр, остановить вакуумный насос и аккуратно снять мембрану с помощью этанолов, стерилизованных щипцов. Поместите всю мембрану в отдельную пробирку объёмом 2 мл. Этот образец будет использован для лечения отделения эндоспор от вегетативных клеток. Образец можно хранить при -20 °C до использования.

4. Лизис вегетативных клеток

1. Провести обработку для отделения эндоспор от вегетативных клеток на биомасе, ранее собранной на мембране NC (шаг 3.6).

1. Если мембрана была заморожена, оставьте её в RT на 10 минут для оттаения. Затем поместите мембрану в стерильную чашу Петри и нарежьте её (примерно 4 раза) на мелкие кусочки с помощью стерилизованных ножниц с этанолом. Затем поместите все части мембранного фильтра в стерильную трубку объёмом 2 мл.

2. Добавьте 900 мкл 1x TE (Tris-EDTA) буфера (см . 1.5) в пробирку с мембраной образца и тщательно перемешайте вихрем. На этом этапе биомасса удаляется из мембраны в раствор TE-буфера.

3. Поставьте трубку в инкубатор при 65 °C на 10 минут и 80 об/мин. После этого достаньте трубку из инкубатора и дайте ей остыть 15 минут.

4. Добавьте 100 мкл свежеприготовленного лизозима (см. 1.5) для достижения конечной концентрации 2 мг/мл. Не добавляйте лизоцим до охлаждения образца до 37 °C, так как это может привести к разрушению фермента.

5. Инкубировать образец при 37 °C в течение 60 минут и 80 об/мин — оптимальных условий для лизоцитирования вегетативных клеток.

6. После завершения лизиса добавьте в образец 250 мкл гидроксида натрия (NaOH) с 3 мкл и 250 мкл раствора 6% додецилсульфата натрия (SDS). При добавлении этого объёма образца достигает 1,5 мл, а итоговая концентрация составляет 0,5 N NaOH и 1% SDS.

7. Инкубировать этот микс на RT 60 минут и 80 об/мин. Добавление основы и моющих средств поможет в итоговом лизе клеток. Концентрация этих моющих средств была оптимизирована так, чтобы не повреждать эндоспоры при лизировании вегетативных клеток.

8. Подготовьте стерильную фильтрационную установку, которая удерживает мембраны диаметром 25 мм, путём автоклава или (если стекло Pyrex) опрыскивания 70% этанола и поджигания горелкой Бунзена. Дайте остыть.

9. Разместить мембрану NC диаметром 0,2 мкм (диаметром 25 мм) на фильтрационный блок с помощью щипцов, стерилизованных пламенем этанола.

10. Добавьте образец с шага 4.7 на мембрану и отфильтруйте жидкость с помощью вакуумного насоса. Когда жидкость пройдёт, выключите вакуумный насос. На этом этапе лизированный вегетативный клеточный материал удаляется, так как он не задерживается на мембране. На мембране останутся только эндоспоры.

11. Добавьте 2 мл стерильного физиологического раствора для смывания остатков моющих средств и фильтруйте жидкость с помощью вакуумного насоса.

12. Когда жидкость полностью отфильтрована, отключите вакуумный насос. Оставьте мембрану на фильтрационном устройстве.

Материалы