Микрофлюидных устройство для воссоздания микроокружение опухоли В Vitro

Summary

Мы представляем порядок изготовления и эксплуатации микрофлюидных устройство, которое воссоздает гетерогенной опухоли микроокружения В пробирке. Изменчивости апоптоза в опухолевой ткани была количественно с помощью флуоресцентных красителей и эффективный коэффициент диффузии химиотерапевтического препарата доксорубицина в опухолевой ткани была оценена.

Abstract

Мы разработали микрофлюидных устройство, которое имитирует доставки и системный клиренс препаратов для гетерогенных трехмерной опухолевой ткани в пробирке. Питательные вещества доставляются на сосудистую не в состоянии охватить все районы опухоли, что приводит к гетерогенным микросреды, состоящей из жизнеспособных, покоя и некротические типов клеток. Многие лекарства от рака не в состоянии эффективно проникать и лечения всех типов клеток из-за этой неоднородности. Монослои раковые клетки не имитировать эту неоднородность, что делает его трудным для тестирования противораковых препаратов с подходящей моделью в пробирке. Наши микрофлюидных устройства были изготовлены из PDMS помощью мягкой литографии. Многоклеточных опухолевых сфероидов, образованных методом висячей капли, были вставлены и ограничены в прямоугольных камерах на устройство и поддерживается с непрерывной перфузии среды на одной стороне. Прямоугольной формы камер на устройство создано линейные градиенты в тканях. Флуоресцентные пятна были использованы для количественной йэлектронной изменчивости апоптоза в ткани. Опухоли на устройство обрабатывали флуоресцентным химиотерапевтического препарата доксорубицина, покадровой микроскопии был использован для мониторинга его диффузии в ткани, и эффективный коэффициент диффузии был оценен. Висячей капли метод позволил быстро формирование единого сфероидов из нескольких линий раковых клеток. Устройство включено роста сфероидов на срок до 3 дней. Клетки в непосредственной близости от протекающей среды было минимальным апоптоза и тех, недалеко от канала были более апоптоза, таким образом, точно имитируя регионах, прилегающих к опухоли кровеносных сосудов. Расчетная величина коэффициента диффузии доксорубицин согласился с ранее сообщал значение в человеческой рака молочной железы. Из-за проникновения и удержания препаратов в твердых опухолей влияет на их эффективность, мы считаем, что это устройство является важным инструментом в понимании поведения наркотиков, и разработка новых терапии рака.

Protocol

1. Устройство изготовления

Репликация микрофлюидных особенности в эластомерных материалов была основана на методике, описанной Даффи и др. ^1.

1. Mix эластомер (полидиметилсилоксана; PDMS) и отвердитель из комплекта кремнийорганический каучук (Dow Corning, Midland, MI) в соотношении 9:1 веса и залить мастер с образованием 4 мм толщины слоя. Дега, чтобы удалить пузырьки воздуха и вылечить смеси при 60 ° C в течение 5 часов. Пил вылечить PDMS из пресс-формы для получения штампа потока особенности на эластомера.
2. Удар отверстия для входа и выхода использовании 1,5 мм биопсии удар (Miltex, Йорк, Пенсильвания), установленных на буровой прессы. Вытащить любой мусор.
3. Подвергать особенностей стороне штамп и чистое предметное стекло для кислородной плазме в течение 8 минут в гравер плазме кислорода. Принесите обработанных поверхностей, контактирующих непосредственно с образованием связи между ними. Поддерживать сборки при 60 ° C на слайде теплее, по крайней мере, 5 часас укрепления связей.
4. Подключите 0,032 "ID PTFE трубки (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) на входах и выходах с помощью интерфейса мужской Luer Lock разъемы прикреплены к колючей женщины Luer Lock разъемы (Qosina, Edgewood, Нью-Йорк).
5. Настройка потока сборки с помощью запорных клапанов и Y-разъем (Upchurch научных, Oak Harbor, Вашингтон; рис. 1). Установите устройство на микроскопе. Прикрепите шприц с трубкой использованием 20G 1,5 "иглы (BD Bioscience, Роквилл, штат Мэриленд).

2. Формирование единого сфероидов

Сфероидов были сформированы методом висячей капли ^2,3.

1. Trypsinize клеток в стерильных капот культуре клеток.
2. Центрифуга трипсинизированных клеток при 2000 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют в 6 мл свежей среды. Разбавьте раствор до желаемой конечной концентрации (табл. 1).
3. Снимите крышку 48-луночный планшет и поместите его вниз головой в Sterilized капот. Циркуляр областях, соответствующих каждой скважине являются очевидными на обложке. Заполните каждую лунку планшета с 1 мл стерильной воды для поддержания влажности. Поместите 20 мкл капли разбавленного раствора ячейки в каждой круговой области использования микропипетки. Аккуратно перевернуть крышкой и поместите его над лунками, обеспечение того, чтобы капли не прикасаться к краям скважины.
4. Инкубируйте а пластины при температуре 37 ° C в течение определенного количества дней (табл. 1). Сфероида будет формироваться в каждой висячей капли.

3. Введение сфероидов в устройство

Обратитесь к рисунку 1 и таблице 2 для этого раздела.

1. Стерилизовать устройство промывки с 70% этанола вводят через потока на входе. Впоследствии, на одном уровне с PBS следуют HEPES буферной среде клеточной культуры. Оставьте _F среду шприц S прикреплены к трубке.
2. Ничья 2-3 сфероидов в шприц _P S, нажмите шприц для удаления пузырьков воздуха, иприкрепляются к упаковке входе в устройство.
3. Открыть впускной клапан V _Pin и близких _Fin V. Открыть выпускной клапан V _Pout и близких _Fout V. Держите упаковки шприцев вертикальные с иглы направлен вниз; наблюдать, как сфероидов оседают на дно шприца в Luer соединением замок иглы. Надавите на поршень на упаковке шприц и часы сфероидов ввести трубку и впадают в устройстве. Потому что только упаковка выпускной клапан открыт, сфероид войдет в камере устройства и храниться сообщения на спине (рис. 2).
4. Закрыть впускной клапан V _Pin и выпускной клапан V _Pout. Установите _F S шприц на шприц насоса. Откройте клапан V _Fin и клапан V _Fout. Поток среды в устройстве на 3 мкл / мин.

4. Введение апоптоза Обнаружение агента (CaspGLOW)

После упаковки камер с сфероидов, позволяющие равновесия для ир до 24 часов, чтобы установить питательных градиенты и микросреды, до введения апоптоза обнаружения или терапевтических агентов. Поскольку ткани в камере находятся в контакте с непроницаемой стены от верха и низа, нет никаких питательных градиенты по толщине (0,15 мм) ткани. После 24 часов инкубации, все клеточные слои по толщине ткани, следовательно, эквивалентны, и только неоднородности в направлении от потока канала.

1. Отключите V _Fin, остановить шприцевой насос, удалить _F шприц S от насоса и заменить его с помощью шприца со средним уровнем содержащий 0,25 мкл / мл CaspGLOW Красной активность каспазы-3 маркера (красный-DEVD-FMK; BioVision, Mountain View, CA).
2. Вручную очистить 0,7 мл этого раствора через устройство для обеспечения перемещения старше среды. Установите шприц на насос, перезапустить поток, и открытое V _фин. В течение 5-8 часов, апоптоз обнаружения агента проникает тОн ткани и флуоресцирует ярче в апоптозе регионов. Апоптоз обнаружения агента на этом концентрация поддерживается во всех последующих решениях потока в устройство.

Примечание:

1. Ткань неоднородность может быть подтверждена путем получения линейных профилей интенсивности флуоресценции, как описано в разделе 6. Профили должны показать пространственные градиенты в апоптозе, подтверждающие, что ткань неоднородна по отношению к жизнеспособности клеток.
2. CaspGLOW Зеленый активность каспазы-3 маркера (флуоресцеин-DEVD-FMK; BioVision) также может быть использован для обнаружения апоптоза. Этот маркер содержит зеленый флуоресцеина флуорофора вместо красной родамина флуорофора.

5. Введение терапевтических агентов

1. Следуйте инструкциям в шагах 4.1-4.2 ввести 10 мкМ доксорубицина гидрохлорид (Dox, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), содержащие апоптоза обнаружения агента.
2. Продолжить поток therapeУтик решение агент в течение фиксированного периода времени. Запорный вентиль V _Fin и выключить шприцевой насос. Заменить лечения шприц с новым шприцем среде, содержащей апоптоза обнаружения агента. Разрешить приток свежего среде в течение 24 -36 часов при непрерывном мониторинге ткани под микроскопом.

6. Замедленной микроскопии и оценивания коэффициентов температуропроводности наркотиков

Для получения чистых данные флуоресценции, приобретают все изображения при фокусировке микроскопа на нижних слоев ткани. Потому что нет никаких питательных градиенты в вертикальном направлении (см. раздел 4), нижний слои клеток хорошо представителей всех других слоев выше.

1. Весь процесс приобретения были автоматизированы с помощью пользовательского сценария в IPLab (BD Bioscience, Роквилл, штат Мэриленд). Приобретать проходящем свете и флуоресценции изображений упакованы сфероида на 10-кратным увеличением каждые 30 минут (рис. 3А). Обретенияэлектронной изображение фоновой флуоресценции до введения Dox. Чтобы приспособить для большой размер камеры (1000 мкм х 300 мкм), приобретение двух смежных изображений и плитку их вместе ^4.
2. Для математической оценки коэффициентов диффузии наркотиков, первым шагом является получение усредненных линейных профилей интенсивности флуоресценции с помощью Dox ImageJ. Выбор прямоугольной области интереса (ROI) охватывает ткани в камере. Используйте команду участок профиля, чтобы создать профиль средней интенсивности в зависимости от расстояния от потока канала. Повторять до 3 различные моменты времени.
3. Получить изображение фоновой флуоресценции до введения Dox для измерения автофлуоресценции из ткани. Вычтите средней интенсивности флуоресценции фон из полученных профилей интенсивности и нормализовать каждый профиль, соответствующий максимальной интенсивности для получения (X, T) (рис. 3B).
4. Следующий шаг заключается в оценке эффективного коэффициента диффузии D от Dox в опухолевой ткани. Dox диффузии может быть представлена ​​следующим уравнением ⁵
   
   где ERFC является дополнительной функцией ошибок, х расстояние в ткани из канала, и т время после введения Dox (см. рис. 3). Используйте следующие итерационная схема в каждый момент времени считается:
   • Угадайте значение D
   • Рассчитать правой стороны уравнения в каждой точке х
   • Вычислить сумму квадратов ошибок (остаточной) между двумя сторонами
   • Изменить D чтобы свести к минимуму остаточные
5. Средняя оптимальные значения D, полученные на каждый момент времени оценить средний эффективный коэффициент диффузии Dox в ткани.

7. Представитель Результаты:

<р = класса "jove_content"> микрофлюидных устройств при условии, 1 мм х 0,3 мм х 0,15 мм оптически доступными камерами культурой для выращивания трехмерных опухолевой ткани. Многоклеточных сфероидов опухоли были доставлены в этих камерах и были сохранены два фильтра сообщений на спине. Висячей капли метод позволил быстрого формирования сфероидов соответствует размеру и форме от нескольких клеточных линий. Сфероидов были успешно выращивают на устройство на срок до 3 дней. Рост в камерах было связано с воспроизводимыми изменения микросреды в сфероидов. Апоптоз произошел менее в клетках, в непосредственной близости от канала потока и более глубже в ткани. Устройство было использовано для оценки коэффициента диффузии доксорубицина в опухолевой ткани. Полученное значение 8,75 х 10 ^-7 см ² с ^-1 согласен со значением 9,1 х 10 ^-7 см ² с ^-1 сообщалось ранее ⁶ в человеческий рак молочной железы.

Клеточная линия	Требуемые концентрации клеток	Инкубационный время
LS174T	300 клеток / мкл	2-3 дней
T47D	750 клеток / мкл	3-4 дней
MDA-MB-231	150 клеток / мкл	5-6 дней

Таблица 1. Параметры для подвешивания сфероидов Выпадение

Часть	Описание
S F	Поток Шприц
S P	Упаковка шприцев
В Fin	Клапан входе
V Pin	Упаковка впускного клапана
В Fout	Клапан Outlet
В Pout	Упаковка выпускной клапан

Таблица 2. Шприцы и клапаны потока в установке

Рисунок 1 Схема потока установки V и V _{Fin Fout.} Потока на входе и выходе клапана, V и V _{Pin Pout:} Упаковка впускных и выпускных клапанов, S _F и S _P: Flow и упаковки шприцев. Упаковки шприцев и упаковки впускной и выпускной клапаны используются, когда сфероид прилетел в камере. Шприц потока и впускные и выпускные клапаны используются для текучей среды в дальнейшем.

Рисунок 2. Схема сфероида попали в камеру на устройстве. Сфероида течет в камеру на устройстве и их два фильтра позTS в задней части камеры.

Рисунок 3. Доксорубицин диффузии в ткани опухоли на устройстве. А. Объединенный проходящем свете и красного флуоресцентного изображения тканей, с указанием расположения и концентрации доксорубицина (в красном). Шкала бар представляет 250 мкм. B. нормализованной линейного профиля интенсивности флуоресценции от доксорубицина.

Discussion

Сосудистой В опухолей является редким и плохо разработанные ^7,8. Есть регионы, расположенные далеко (> 100 мкм) из кровеносных сосудов, которые являются недоступными для питательных веществ и лекарств, поставляемых хотя сосудистой ^9. В результате гетерогенной микроокружения вносит свой ​​вклад в ограниченную эффективность многих химиотерапевтических ^10. Микрофлюидных устройство, разработанное здесь воссоздает гетерогенных микроокружения опухоли характеризуются разрастаются, покоя и ап...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Комплект силиконовые эластомеры	Ellsworth клеи	184 Sil Elast Kit
Miltex биопсии удар	MedexSupply	MTX-33-31AA	1,5 мм
PTFE трубки	Cole Parmer	EW-06417-31	0,032 "ID
Мужской Luer Lock разъем	Qosina	65111
Колючая женщины Luer соединением замок	Qosina	11556
Запорный клапан	Идекс здравоохранения и науки	P-721
Y-коннектор	Идекс здравоохранения и науки	P-513
20G 1,5 "иглы	BD Biosciencэлектронной	305176
Трипсина-EDTA	Invitrogen	25300-054
HEPES	Сигма	H-4034
CaspGLOW Fluorescein	BioVision	K183-25
CaspGLOW красный	BioVision	K193-25
Доксорубицина гидрохлорид	Сигма	44583
LS174T	ATCC	CCL-188	Толстой кишки человека клеточной линии карциномы
T47D	ATCC	HTB-133	Ductal человека клеточной линии рака
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26	Молочной железы человека клеточной линии аденокарциномы