Флуоресцентно маркированная репрессорная блокировка с белком репликации у Escherichia coli

Аннотация

Источник: Меттрик, К. А., Лоуренс и др., Индуцирование локально-специфичной блокировки репликации в E. coli с помощью системы операторов флуоресцентного репрессора. J. Vis. Exp . (2016)

В этом видео демонстрируется сайт-специфическая блокировка вилки репликации у Escherichia coli с помощью арабиндуцированной экспрессии желтого флуоресцентного белкового TetR, который связывает хромосомные teTO-массивы.

Протокол

1. Блокирующая репликация с помощью системы операторов флуоресцентного репрессора (FROS)

1. Индуцирование блокировки репликации
   1. Разбавить свежую ночную культуру штамма E. coli с массив teTO и pKM118 до_{OD 600}нм = 0,01 в разбавленной сложной среде (0,1% триптона, 0,05% экстракта дрожжей, 0,1% NaCl, 0,17 M KH₂PO₄, 0,72 M K_{2HPO 4}) антибиотиками при необходимости для отбора.
      ЗАМЕТКА: Не добавляйте тетрациклин для отбора, так как он несовместим с этой системой. Сделайте объём посева эквивалентным 10 мл на требуемый образец. Например, объём культуры для экспериментального дизайна на рисунке 1 составляет 60 мл.
   2. Выращивайте при 30 °C с встряхиванием до_{OD 600} нм = 0,05-0,1. Удалите образец объёмом 10 мл для неиндуцированного контроля и добавьте 0,1% арабинозы в оставшуюся культуру, чтобы стимулировать выработку TetR-YFP из pKM1. Продолжайте выращивать как неиндуцированные, так и индуцированные культуры. Через 1 час проверьте наличие одной фокальной точки в каждой клетке индуцированной культуры с помощью флуоресцентной микроскопии.
   3. Если индуцированные клетки подтверждены блокировкой (более 70% клеток имеют один фокус), зафиксируйте_{OD 600}нм и возьмите образец объёмом 7,5 мл для анализа 2-D гелями. Возьмём эквивалентный образец из культуры неиндуцированного контроля.

Результаты

Рисунок 1: Обзор блока репликации FROS и экспериментальной процедуры выпуска. Штаммы E . coli, несущие массив teTO, выращиваются при 30 °C. Когда клетки достигают_{OD 600}нм выше 0,05, выработка TetR-YFP индуцируется арабинозой...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Триптон	Сигма-Олдрич	16922	Компонент среды роста
Хлорид натрия	VWR	27810.364	Компонент среды роста
Экстракт дрожжей	Сигма-Олдрич	92144	Компонент среды роста
Монобазичный калийфосфат	Сигма-Олдрич	P9791	Компонент среды роста; Компонент калийного буфера
Калийфосфат дибазичный	Сигма-Олдрич	P3786	Компонент среды роста; Компонент калийного буфера
L-Arabinose	Сигма-Олдрич	A3256	Для индукции производства TetR-YFP
Флуоресцентный микроскоп Axioskop 2	Zeiss	452310	Визуализация клеток
Набор фильтров eYFP	Chroma Technology	41028	Визуализация YFP
CCD-камера	Хамамацу	Orca-AG	Визуализация клеток
Программное обеспечение MetaMorph (молекулярные устройства)	SDR Scientific	31282	Версия 7.8.0.0, использовавшаяся при подготовке этой рукописи