Петлевидная изотермическая амплификация для обнаружения бактериальных генов

Аннотация

Источник: Домесле, К. Дж . и др. Петля-опосредованная изотермическая амплификация для скрининга сальмонеллы в животном продукте и подтверждения сальмонеллы при выделении культуры. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется метод изотермической амплификации с петлевой опосредованностью (LAMP) для обнаружения гена-мишени бактерий путём амплификации ДНК при постоянной температуре. Реакционная смесь готовится путём добавления изотермической мастер-смеси, специфических праймеров для целевого гена и образцов с ДНК-шаблонами. Амплификация инициируется в приборе LAMP, а флуоресценция в реальном времени отслеживается для подтверждения наличия гена-мишени.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь реакций с изотермической амплификацией, опосредованной через петлю (LAMP), содержит ДНК-полимеразу, буфер, сульфат магния (_{MgSO 4}), дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), праймеры, шаблон ДНК и воду. Первые четыре реагента содержатся в изотермической мастер-смеси (Таблица материалов). Праймеры предварительно смешиваются внутри компании, чтобы получить смесь грунта (10 раз). Шаблоны ДНК могут быть подготовлены из обогащающих бульонов образцов пищи животных для целей скрининга или из культур предполагаемых изолятов сальмонеллы для подтверждения. Кроме того, в каждом запуске LAMP включены положительный контроль (ДНК, извлеченная из любых эталонных штаммов Salmonella , например, Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) и контроль без шаблонов (NTC; стерильная молекулярная вода).

1. Подготовка ДНК-шаблонов

1. Чтобы подготовить шаблоны ДНК из обогащений пищи животных, следуйте следующим шагам.
   1. Асептически взвесьте 25 г образца корма для животных (например, сухой корм для кошек, сухой корм для собак, корма для крупного рогатого скота, корма для лошадей, корм для птицы и корм для свиней) в стерильный фильтрующий мешок (Таблица материалов) или эквивалент. Поместите мешок в большой контейнер или стойку для поддержки во время инкубации.
   2. Добавьте 225 мл стерильной буферной пептонной воды (BPW). Хорошо смешивайте, размешивая и делая короткий массаж рук. Дайте постоять при комнатной температуре 60 ± 5 минут.
   3. Хорошо перемешайте, помешав и определите pH с помощью тестовой бумаги. При необходимости скорректируйте pH до 6,8 ± 0,2 стерильного гидроксида натрия (NaOH) или 1 N соляной кислоты (HCl). Инкубировать при 35 ± 2 °C в течение 24 ± 2 часа.
   4. Хорошо перемешайте, помешав мешок с бульонами для обогащения пищи животных. Перенесите 1 мл с фильтрованной стороны пакета в микроцентрифугную трубку. Вихрь на мгновение.
   5. Извлекать ДНК с помощью реагента для подготовки образцов (таблица материалов) следующим образом.
      1. Центрифугу при 900 г в течение 1 минуты, чтобы удалить крупные частицы и перенести супернатант в новую микроцентрифугальную трубку.
      2. Центрифугу при 16 000 x g на 2 минуты и отбросьте супернатант.
      3. Подвесить гранулу в 100 мкл реагента для подготовки образца и нагреть при 100 ± 1 °C в сухом тепловом блоке в течение 10 минут.
      4. Охладите до комнатной температуры и храните экстракты образца ДНК при -20 °C.
2. Чтобы подготовить шаблоны ДНК из предполагаемых культур сальмонеллы , следуйте следующим шагам.
   1. Получение предполагаемых изолятов сальмонеллы из культурной изоляции во всех продуктах питания согласно BAM Глава 5, раздел D: Изоляция сальмонеллы FDA.
   2. Инокулятные предполагаемые сальмонеллы изолируются на неселективной агаровой пластине (например, кровавый агар, питательный агар и соевый агар, триптиказа) и инкубируют при 35 ± 2 °C в течение 24 ± 2 часа.
   3. Пересадите несколько отдельных колоний в 5 мл бульона из соевого бульона триптиказы (TSB) или инфузии мозгового сердца (BHI) и инкубировать при 35 ± 2 °C в течение 16 ± 2 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть необязательным, если предполагаемая культура сальмонеллы чиста. В таком случае ДНК-шаблоны можно подготовить, подвесив несколько отдельных колоний в 5 мл TSB и нагрев 500 мкл суспензии при 100 ± 1 °C в течение 10 минут в сухом тепловом блоке. Продолжайте шаг 5 ниже.
   4. Перенесите 500 мкл ночной культуры в микроцентрифугную трубку и нагрейте при 100 ± 1 °C в течение 10 минут в сухом тепловом блоке.
   5. Охладите до комнатной температуры и храните изолированные экстракты ДНК при -20 °C.
3. Для получения положительной контрольной ДНК следуйте аналогичным шагам для подготовки шаблонов ДНК из предполагаемых культур сальмонеллы с одним дополнительным этапом разбавления.
   1. Инокуляйте S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) или любые эталонные штамы сальмонеллы на неселективную агарную пластину (например, кровавый агар, питательный агар и соевый агар-триптика) и инкубируют при 35 ± 2 °C в течение 24 ± 2 часа.
   2. Перенесите несколько отдельных колоний в 5 мл бульона TSB или BHI и инкубируют при 35 ± 2 °C в течение 16 ± 2 часа, чтобы достичь ~10⁹ CFU/mL.
   3. Последовательно разводите ночную культуру в пептонной воде 0,1%, чтобы получить ~10⁷ CFU/mL.
   4. Передайте 500 мкл этого разбавления в микроцентрифугную трубку и нагрейте при 100 ± 1 °C в течение 10 минут в сухом тепловом блоке.
   5. Охладите до комнатной температуры и храните положительную контрольную ДНК при -20 °C.

2. Приготовление грунтовой смеси (10 раз)

1. Получите коммерчески синтезированные LAMP-праймеры (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF и Sal4-LB) с помощью стандартной очистки десолью (Таблица 1). Подготовьте стандартные растворы каждого грунта (100 мкм), увлажнив грунт соответствующим запасом стерильной молекулярной воды. Хорошо перемешайте с помощью вихря в течение 10 секунд и храните при -20 °C (-80 °C для длительного хранения).
2. Подготовьте грунтовую смесь (10 раз) согласно рабочему листу (Таблица 2). Добавьте соответствующие объемы растворов грунтовки и стерильной молекулярной воды в микроцентрифугную трубку. Хорошо смешивайте все реагенты, вихря в течение 10 секунд. Смесь праймера в 10 раз на 500 мкл на пробирку микроцентрифуги наполните и храните при -20 °C.

3. Сборка реакции LAMP

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение, настоятельно рекомендуется физически разделить участки, используемые для приготовления мастер-смеси LAMP, и добавления ДНК-шаблонов. Рисунок 1 — это диаграмма LAMP.

1. Подготовка и подготовка к пробегу
   1. Чистый стенд с изопропанолом и раствором для разложения ДНК и ДНКазы (Таблица материалов). Очистите пипетки и держатели для полосок трубок (таблица материалов) раствором, разлагающим ДНК- и ДНКазу.
   2. Разморозить изотермальную мастер-смесь, грунтовую смесь (10 раз), молекулярную воду, положительную контрольную ДНК и шаблоны ДНК при комнатной температуре.
   3. Включите прибор LAMP (таблицу материалов) и нажмите на открывающий экран, чтобы получить доступ к главному экрану. Следуйте этим шагам, чтобы создать забег.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна модель прибора LAMP содержит 2 блока (A и B) с 8 образцами в каждом блоке, а другая модель имеет один блок, вмещающий 8 образцов (Таблица материалов).
      1. Нажмите LAMP+Anneal и выберите Редактировать , чтобы ввести образцовую информацию.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Профиль работы LAMP по умолчанию включает усиление при 65 °C в течение 30 минут и отжигающую фазу от 98 °C до 80 °C с уменьшением 0,05 °C в секунду.
      2. Нажмите на каждую строку сэмпла, чтобы активировать курсор и ввести соответствующую информацию о сэмпле, используя значок блока AB для переключения между двумя блоками приборов LAMP.
      3. Нажмите на значок Check , когда вся информация о образце введена.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально, настройка запуска (называемая «Профиль», содержащая образцовую информацию вместе с стандартным профилем запуска LAMP) может быть сохранена для дальнейшего использования. Нажмите на иконку «Сохранение » и дайте профилю уникальное имя. При следующем тестировании этого же набора сэмплов можно инициировать новый запуск с помощью сохранённого профиля. Нажмите на значок папки в левом нижнем углу главного экрана и выберите Профиль , чтобы загрузить сохранённые профили.
2. Реактивная сборка LAMP
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании обоих инструментальных блоков LAMP (A и B, всего 16 сэмплов) подготовьте мастер-микс LAMP на 18 сэмплов. Если используется только один блок LAMP (всего 8 сэмплов), подготовьте мастер-микс LAMP на 10 сэмплов. Для других номеров выборок регулируйте объём соответственно, чтобы учесть потери при пипетировании. Всегда включайте положительный контроль и NTC в каждом запуске LAMP. Рекомендуется дублировать тестирование каждого образца в независимых LAMP-запусках.
   1. Подготовьте мастер-микс LAMP согласно рабочему листу (Таблица 3). Добавьте соответствующие объёмы изотермической мастер-смеси, грунтовой смеси и молекулярной воды в микроцентрифугную трубку и аккуратно проведите вихрь в течение 3 секунд. Ненадолго центрифугите.
   2. Поместите ленту трубки в держатель и распределите по 23 мкл мастер-смеси LAMP в каждую скважину.
   3. Вихрь всех шаблонов ДНК и кратковременно центрифуга. Добавьте 2 мкл ДНК-шаблона в соответствующую скважину и плотно закройте.
   4. Снимите полоску трубки с держателя и дерните запястьем, чтобы убедиться, что все реагенты скопились на дне трубки.
   5. Загрузите ленту трубки в блок(и) приборов LAMP, убедившись, что конденсаторы надёжны, прежде чем закрыть крышку.

4. LAMP Run

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время запуска LAMP флуоресцентные показания получаются с помощью канала FAM. Значения от времени к пику (Tmax; min) автоматически определяются прибором для момента, когда коэффициент флуоресценции достигает максимального значения кривой скорости усиления. Tm (°C) — это температура плавления/отжига конечного усиленного продукта.

1. Нажмите на значок Run в правом верхнем углу экрана и выберите блок(и), содержащие трубчатые полосы, чтобы начать запуск LAMP.
2. По желанию, пока идёт реакция, нажмите на вкладки «Температура», «Усиление» и «Отгорев», чтобы увидеть динамические изменения различных параметров во время запуска LAMP.
3. После завершения запуска нажмите на вкладки Amplification и Anneal , чтобы увидеть полные кривые усиления и отнел, а затем нажмите на вкладку Results , чтобы увидеть результаты.
4. По желанию, для ведения записи, записывайте номер серии, расположенный в левом верхнем углу экрана, используя формат «серийный number_run инструмента», например, «GEN2-2209_0030».

Таблица 1: Праймеры LAMP для скрининга сальмонеллы в корме животных и подтверждения сальмонеллы из культурной изоляции. Праймеры разработаны на основе последовательности Salmonella invA (регистрационный номер GenBank M90846).

Название буквы	Описание	Последовательность (5'-3')	Длина (bp)
Sal4-F3	Передний внешний грунт	GAACGTCGCGGGAAGTC	18
Sal4-B3	Обратная внешняя грунтовка	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Внутренний капсюль вперёд	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Внутренний капсюль обратно	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Контурная прямая капсула	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Петля с обратным грунтом	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Таблица 2: Рабочий лист по приготовлению смеси грунта LAMP (10 раз). Праймеры перечислены в таблице 1.

Компонент	Стандартный конк. (μM)	Смесь грунта conc. (μM)	Объём (мкл)
Капсуль Sal4-F3	100	1	10
Капсуль Sal4-B3	100	1	10
Капсюль Sal4-FIP	100	18	180
Праймер Sal4-BIP	100	18	180
Капсюль Sal4-LF	100	10	100
Капсюль Sal4-LB	100	10	100
Молекулярная вода	Н/Д	Н/Д	420
Итог	Н/Д	Н/Д	1000

Таблица 3: Рабочий лист для подготовки реакционной смеси LAMP. Смесь грунтовки (10x) готовится согласно Таблице 2 с использованием стандартных растворов грунтовок, указанных в Таблице 1.

Компонент	Работаю на конксистенце.	Финальная реакция conc.	Объём на образец (мкл)	Объём на 18 образцов (мкл)	Объем на 10 образцов (мкл)
Изотермическая мастер-смесь ISO-001	1,67x	1 раз	15	270	150
Смесь грунта	10 раз	1 раз	2.5	45	25
Молекулярная вода	Н/Д	Н/Д	5.5	99	55
Тотал мастер-микса	Н/Д	Н/Д	23	414	230
Шаблон ДНК	Н/Д	Н/Д	2	Н/Д	Н/Д

Результаты

Рисунок 1: Схематическая схема рабочего процесса LAMP по сальмонелле.

Материалы