Электропорационная доставка флуоресцентных биомолекул в бактериальные клетки

Аннотация

Источник: Айгрейн, Л. и др. Интернализация и наблюдение флуоресцентных биомолекул в живых микроорганизмах с помощью электропорации. J. Vis. Exp .(2015)

Видео демонстрирует доставку флуоресцентных биомолекул в электрокомпетентные микробные клетки с помощью электропорации. Процесс начинается с внедрения фторофорной ДНК или белков в охлаждённую клеточную суспензию. Затем применяется высоковольтный импульс для создания временных пор мембраны, позволяющих биомолекуле проникнуть в цитоплазму. После восстановления клетки проходят промывку и фильтрацию для удаления неинтернализированных или поверхностно скреплённых молекул. Наконец, маркированные клетки устанавливаются для флуоресцентной визуализации внутриклеточных компонентов.

Протокол

1. Электропорация

1. Инкубация
   1. Добавьте до 5 мкл маркированных молекул, хранящихся в буфере с низким содержанием соли (< 50 мл соли), в одну аликвоту компетентных клеток (20 мкл бактерий или 50 мкл дрожжей) и инкубировать 10 минут на льду.
      ЗАМЕТКА: Концентрация флуоресцентно маркированных молекул в стандартных растворах и, соответственно, количество помеченных молекул, добавленных в ячейку до электропорации, напрямую коррелируют с эффективностью нагрузки (Рисунок 1 и обсуждение). Поскольку некоторые белки менее совместимы с условиями низкого содержания соли, концентрация соли в буфере хранения может быть увеличена, но объём добавленных к клеткам до электропорации необходимо уменьшить.
   2. Переместить смесь клеток и миченых биомолекул в предварительно охлаждённую электропорационную кювету (с интервалом 0,1 и 0,2 см соответственно для бактерий и дрожжей). Аккуратно постучите кюветкой по столу, чтобы удалить возможные пузырьки из раствора.
   3. Поместите кювету в электропоратор и подайте к раствору высоковольтный электрический импульс (0,9–1,8 кВ/см, см. обсуждение выбора напряжения для подробностей). Такой импульс образует временные поры в клеточных мембранах, позволяя меченым биомолекулам диффундировать в клетки.
   4. Проверьте, что временная константа, отображаемая на электропораторе, составляет от 4 до 6 мс. Низкие временные константы часто обусловлены слишком высокой концентрацией соли и/или наличием пузырьков в кювете, что приводит к очень низкой или отсутствующей нагрузке ячеек.
2. Выздоровление
   1. Сразу после электропорации добавьте 500 мкл богатой среды, такой как супер-оптимальный бульон с катаболитной репрессией (SOC), EZ Rich Defined Medium, экстракт дрожжей Пептонная декстроза (YPD) или любую богатую среду.
   2. Инкубировать образец при 37 °C для бактерий и 29 °C для дрожжей в течение 2–10 минут. Для измерения жизнеспособности, когда пользователь хочет оценить процент роста и деления клеток после электропорации, используйте более длительное время восстановления (до 1 часа), так как мы наблюдаем такие задержки до первого деления клетки.
3. Ступени для мытья
   1. Промыйте клетки для удаления неинтернализированных биомолекул, вращая их вниз в течение 1 минуты при температуре 3300 x g и 4 °C. Выбросьте супернатант и снова суспензуйте клетки в 500 мкл физиологического раствора (PBS).
      ЗАМЕТКА: Для каждого образца подготовьте отрицательный контроль клеток, инкубированных с таким же количеством меченых биомолекул, но не электропорированных и не промытых точно так же, как основной образец.
   2. Повторите предыдущие шаги три раза.
   3. В случае интернализации белка оптимизируйте процедуру промывания в зависимости от свойств и поведения отмеченного белка. Следующие шаги приведены примерами возможных оптимизаций:
      1. Проведите первые три цикла промывания с использованием PBS, содержащего 100 мМ NaCl и 0,005% Triton X-100, чтобы удалить неинтернализированные белки, которые могут прилипнуть к внешней клеточной мембране.
         1. Фильтруйте электропорированные клетки с помощью порового фильтра диаметром 0,22 мкм, установленного в микроцентрифугной трубке объемом 1,5 мл, путём пипетирования электропорированных элементов в фильтр. Опустите проток на 3 минуты при 800 x g и 4 °C. Отбросьте проток прокатов. Добавьте 500 мкл нового PBS поверх ячеек и снова вращайте их как раньше, повторяя эти шаги один раз.
      2. Добавьте небольшое количество протеазы K (10 нг в 500 мкл PBS) в первом цикле промывки, чтобы обеспечить переваривание любого неинтернализированного белка.
   4. Закрутите клетки на 1 минуту при 3300 x g и 4 °C. Отбросьте супернатант и снова суспензуйте клетки в 150 мкл PBS.
   5. Распределите раствор загруженной ячейки на агарозной площадке, убрав верхний ковер и распределив 10 мкл суспензии ячейки капля за каплёй. Замените неиспользованную чистую, сгоревшую затяжку (толщина No 1,5, совпадающая с спецификацией микроскопа) на верхнюю часть площадки и очень аккуратно нажмите на затвор.
   6. Защитите электропорированные клетки от света, храня прокладки в непрозрачной коробке, одновременно снимая разные образцы.

Результаты

Рисунок 1: Подсчёт количества внутренних молекул с помощью фотоотбеливающего анализа. (A) Одноклеточный фотоотбеливающий анализ. Примеры временных трассий интенсивности флуоресценции (синий: сырые данные; красный: подгонка...

Материалы