Подготовка образцов Myxococcus xanthus для изображения живых клеток

Аннотация

Источник: Шумахер, Д. и др. Флуоресцентное живоклеточное изображение полного вегетативного клеточного цикла медленнорастущей социальной бактерии Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется подготовка и визуализация Myxococcus xanthus — медленнорастущей почвенной бактерии. Культура выращивается в окружающей среде, наносится на покрытие с флуоресцентными микросферами и накладывается на заранее подогретую агарозную подушечку для поддержки гидратации и питательных веществ. Такая система позволяет проводить долгосрочную временную живую визуализацию клеточных процессов во время деления бактериальных клеток.

Протокол

1. Подготовка образцов микроскопии

Заметка: Клетки, предназначенные для микроскопии, помещаются на микроскопическое покрытие, а затем покрываются агарозной подушечкой с питательными веществами. Накладка приклеена к пластиковой или металлической раме для механической поддержки. В подготовке к микроскопии заранее следует подготовить большую площадку с 1% агарозой/TPM/0,2% CTT, как описано в шагах 2.1–2.3. Пожалуйста, также ознакомьтесь с Таблицей материалов для конкретных используемых здесь продуктов.

1. Подготовьте 500 мл буфера TPM (10 мМ Tris-HCl pH 7,6, 1 мМ KH₂PO₄ pH 7,6, 8 мМ MgSO₄) и стерилизуйте автоклав или фильтр с помощью фильтра с крышкой бутылки.

ЗАМЕТКА: Стерильный буфер можно хранить несколько месяцев при комнатной температуре.

2. Приготовьте 1% агарозный микроскопический раствор, содержащий 0,2% КТТ (смешайте 1 г агарозы с 80 мл буфера TPM и 20 мл среды 1% КТТ). Разогревайте в микроволновке до расплавления агарозы.

ЗАМЕТКА: КТТ 0,2% достаточно, чтобы клетки могли расти и предотвратить голодание. Более высокие концентрации КТТ в микроскопической среде приводят к высокой фоновой флуоресценции.

3. Наполните чашку Петри расплавленной агарозой толщиной 0,5 см (для чашки Петри размером 11,5 см на 11,5 см требуется примерно 60 мл расплавленной агарозы) и дайте ей остыть до комнатной температуры.

ЗАМЕТКА: Агарозная подушечка может храниться при 4 °C во влажной среде до 2 дней.

1. Предварительно прогрейте 1% агарозу/TPM/0,2% CTT при 32 °C не менее 15 минут перед использованием.

ЗАМЕТКА: Чтобы подготовить клетки к микроскопии, следуйте шагам 2.4–2.8.

4. Разместить стерильную стеклянную накладку (60 мм x 22 мм, толщина: 0,7 мм) на пластиковую или металлическую раму с отверстием посередине (рисунок 1A); Эта рама служит механической опорой для тонкого скольжения и помогает уменьшить дрейф во время микроскопии. Прикрепите обложку к раме скотчем.

1. Для подготовки рамы вырежьте раму диаметром 75 мм × 25 мм из металлической пластины толщиной 1 мм, затем вырежьте отверстие соответствующего размера (20 мм × 30 мм в этом эксперименте) в центре.

5. Добавьте 10–20 мкл экспоненциально выращенных клеток M. xanthus на покрытие.

6. Добавить флуоресцентные микросферы 0,5 мкм в качестве фидуциальных маркеров к клеткам для упрощения отслеживания клеток или белков в таймлапс-записях.

1. Разбавить микросферы в буфере TPM 1:100 и хранить при 4 °C до нескольких месяцев. Тщательно встряхните перед использованием и добавьте 5–10 мкл разбавленных микросфер в клетки.

ЗАМЕТКА: Здесь использовались микросферы, флуоресцентные во всех распространённых синих, зелёных, жёлтых и красных люминесцентных каналах.

7. Вырежьте небольшую подушечку примерно размером с покрытие большого предварительно нагретого 1% агарозы/TPM/0,2% CTT и разместите её поверх ячеек (рисунок 1B). Положите покров сверху на агарозную прокладку 1% агарозы/TPM/0,2% CTT, чтобы предотвратить испарение и поддерживать клетки во влажной среде.

ЗАМЕТКА: Само покрытие предотвращает значительное испарение как минимум на 2 часа. Для более длительных таймлапс-записей 1% агароза/TPM/0,2% CTT pad и сэндвич с ковлзом должны быть запечатаны парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение.

8. Инкубировать микроскопический образец при 32 °C в течение 15–20 минут, чтобы клетки прикрепились к дну агарозного подушечника. Затем начните записи таймлапс-микроскопии.

Результаты

Рисунок 1: Схема экспериментальной установки, использованной на протяжении всего исследования. (A) Металлическая или пластиковая рама служит опорой для образца. На металлической раме закрепляется ковл-слайк с помощью ленты, ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMI6000B с AFC	Микросистемы Leica	11888945	Автоматический инвертированный широкопольный флуоресцентный микроскоп с адаптивным управлением фокусировки
Универсальная монтажная рама	Микросистемы Leica	11532338	Держатель для сцены для разных размеров выборок
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3	Микросистемы Leica	11506197	Объектив фазового контраста
Камера Orca Flash 4.0	Хамамацу	11532952	4,0-мегапиксельная sCMOS-камера для захвата изображений
Набор фильтров TXR ET, k	Микросистемы Leica	11504170	Набор флуоресцентных фильтров, Пример: 560/40 Эм: 645/75
Набор фильтров L5 ET, k	Микросистемы Leica	11504166	Набор флуоресцентного фильтра, Пример: 480/40 Эм: 527/30
Набор фильтров YFP ET, k	Микросистемы Leica	11504165	Набор флуоресцентных фильтров, Например: 500/20 Эм: 535/30
ProScan III	Предшествующий	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Контроллер автоматизации микроскопа с интерактивным центром управления
Источник света EL 6000	Микросистемы Leica	11504115	Внешний источник флуоресцентного света
Incubator BLX Black	Пекон	11532830	Чёрная инкубационная камера вокруг микроскопа
Контроль температуры 37-2 цифровой	Микросистемы Leica	11521719	Автоматический контроль температуры для инкубационной камеры
Генмициновый сульфат	Карл Рот	233.4	Гентамицин
Окситетрацилин-дигидрат	Сигма Олдрич	201-212-8	Окситетрациклин
Сульфат канамицина	Карл Рот	T832.3	Канамицин
Фильтр Filtropur BT25 с крышкой бутылки 0.2	Сарштедт	831,822,101	Фильтр на крышке бутылки для стерилизации буферов
Deckgläser	VWR	630-1592	Стеклянная крышка (60 x 22 мм, толщина: 0,7 мм)
Seakem LE agarose	Лонза	50004	Агароза для микроскопических слайдов
Leica Metamorph AF	Микросистемы Leica	11640901	Программное обеспечение для управления микроскопом и для анализа изображений
Tetraspeck Microsperes, 0,5 мкм	ThermoFisher	T7281	Флуоресцентные микросферы
чашка Петри	Bio-one Грейнера	688102	120 мм x 120 мм x 17 мм квадратная чашка Петри для агарозных подушек
BD Бакто Каситоне	Бектон Дикинсон	225930	Каситоне
Parafilm M	VWR	291-1213	Парафильм
Трис(гидроксиметил)-аминометан	Карл Рот	AE15.2	Трис
Гептагидрат сульфата магния	Карл Рот	P027.2	Сульфат магния
Калий дигидрофосфат по популярности.	Карл Рот	3904.1	Дигидрофосфат калия
1% КТТ-среда: 1 % (в/в) BD™ Bacto каситон, 10 мМ Tris-HCl ph 8,0, 1 мМ буферный pH фосфатного калия 7,6, 8 мМ MgSO₄			Среда для культивации M.xanthus
Буфер TPM: 10 мМ Tris-HCl ph 8,0, 1 мМ буфер фосфатного калия pH 7,6, 8 мМ MgSO₄			Буфер для подготовки микроскопических препаратов для M.xanthus