Точный и высокопроизводительный анализ роста бактерий с помощью считывателя микропластин

Аннотация

Источник: Курокава, М. , и др. Точный и высокопроизводительный анализ роста бактерий. J. Vis. Exp . (2017)

Это видео демонстрирует высокопроизводительную количественную оценку роста бактерий с помощью считывателя микропластин. В нём описываются этапы подготовки культуры, измерения оптической плотности и анализа динамики роста.

Протокол

1. Запись роста в реальном времени
   1. Нарисуйте 96-ядровую пластинную пиктограмму (таблица 8 × 12), чтобы указать расположение инокуляционных образцов культуры на 96-луночной пластине. Распечатайте таблицу и используйте её как справочник для эксперимента.
      ЗАМЕТКА: Скважины, расположенные по краям микропластины, должны содержать только пустую среду из-за испарения.
   2. Разместите стерилизованную 96-колодную плоскую микропластину с крышкой, наконечниками пипеток P-1000, 1000 мкл, наконечниками пипеток P-200, 200 мкл, несколькими микротрубками по 1,5 мл, 8-канальной пипеткой, резервуаром для стерилизованного реагента, запасами M63 комнатной температуры и запасами глицерила Escherichia coli на чистом столе.
   3. Добавьте примерно 25 мл M63 в реагентный резервуар. Используйте этот резервуарный приклад для всех следующих этапов.
   4. Добавьте 900 мкл M63 в микротрубки в подготовке к проведению последовательных разбавлений.
   5. Разморозьте глицероловый запас при комнатной температуре. Добавьте 900 мкл M63 к размораженному глицероловому булью и вихрю. Это приводит к 10-кратному разбавлению исходного глицеролового запаса.
   6. Перенесите 100 мкл 10-кратного разбавления в другую микротрубку, содержащую 900 мкл M63 и вихре. Это приводит к разбавлению в 100 раз.
   7. Повторяйте шаг 1.6, пока не будет достигнуто нужного количества разбавлений.
   8. Заполните скважины на краю микропластины 200 мкл M63 с помощью 8-канальной пипетки (P-200).
      ЗАМЕТКА: Эти скважины можно использовать как заготовку.
   9. Загрузите 200 мкл каждого разбавлённого образца, приготовленного на этапах 1,4–1,7, в микропластинчатые скважины согласно справочной таблице (шаг 1.1). Вихрь разбавленных образцов перед загрузкой и загрузить один и тот же образец в несколько скважин в разных местах пластины.
   10. Поставьте 96-яструнную микропластину на считыватель пластин.
   11. Откройте «Читать сейчас» в «Диспетчере задач» и выберите программу. Нажмите «OK», чтобы начать измерение. Сохраните запись в виде нового экспериментального файла для анализа данных.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дикалийфосфат	Вако	164-04295
Монокалиев фосфат	Вако	166-04255
Сульфат аммония	Вако	019-03435
Гептагидрат сульфата магния	Вако	138-00415
Тиамин-HCl	Вако	201-00852
Глюкоза	Вако	049-31165
Список совместимого оборудования	Вако	080-01066
Гептагидрат сульфата железа (II)	Вако	094-01082
КО	Вако	168-21815
Глицерин	Вако	075-00611
Кончики пипет, 200 мкл	УОТСОН	110-705Y
Кончики пипет, 1 000 мкл	УОТСОН	110-8040
Микротрубка (1,5 мл)	УОТСОН	131-715C
8-канальная пипетка	УОТСОН	NT-8200
Пасорина мешалка	КАК ОДНО	2-4990-02
Стеклянный цилиндр (200 мл)	КАК ОДНО	1-8562-07
Точный pH-метр	КАК ОДНО	AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	ГИЛСОН	1-6855-05
Pipetman P-1000	ГИЛСОН	1-6855-06
Подставка для микротрубок	BM Bio	801-02Y
Вихрь	BM Bio	BM-V1
Микропластина Corning Costar с 96 лунками и крышкой (плоское дно, прозрачное)	Сигма-Олдрич	Корнинг, 3370
Реагентный резервуар Corning Costar (50 мл)	Сигма-Олдрич	Корнинг, 4870
EPOCH2	BioTek	2014-EP2-002 / EPOCH2T
BIO clean bench	Panasonic	MCV-B131F
Бактериальные штаммы	Организация банков напряжения; Национальный проект биоресурсов (NBRP) в Японии