Оценка активности бактериального шаперона через термическое разворачивание модельного белка

Аннотация

Источник: Dahl, J. и др. Обнаружение pH-зависимой активности Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro и in vivo. J. Vis. Exp . (2016)

В этом видео демонстрируется анализ на основе флуоресцентного спектрофотометра для оценки активности шаперонов на белке субстрата под кислотным и тепловым стрессом. В нём изложены этапы мониторинга разворачивания и агрегации субстрата с помощью рассеяния света, сравнивая условия с и без сопровождающего.

Протокол

1. Анализ активности шаперонов с использованием термически разворачивающейся малатдегидрогеназы (MDH)

ЗАМЕТКА: Влияние очищенного HdeB на агрегацию термически разворачивающейся свиной митохондриальной малатдегидрогеназы (MDH) при различных значениях pH отслеживалось, как описано ниже. Все перечисленные концентрации белка относятся к концентрации мономера.

1. Для подготовки MDH диализируйте MDH при 4 °C ночью против 4 л буфера C (50 мМ калий фосфат, 50 мМ хлорида натрия (NaCl), pH 7,5) и концентрируйте белок примерно до 100 мкм с помощью центробежных фильтров с молекулярным порогом 30 кДа.
   ЗАМЕТКА: Требуется тщательный диализ MDH, так как MDH подаётся в виде раствора сульфата аммония.
2. Для удаления агрегатов центрифугуйте белок в течение 20 минут при 20 000 x g при 4 °C. Определите концентрацию MDH посредством поглощения на 280 нм (_{ε 280 нм} = 7 950 ^{м-1 см-1}). Подготовьте 50 мкл аликвотов MDH и быстро заморозьте аликвоты для хранения.
3. Поместите кварцевую кювету объемом 1 мл в флуоресцентный спектрофотометр, оснащённый держателями и мешалками для образцов с контролируемой температурой. Установите λ_ex/em на 350 нм.
4. Добавьте соответствующие объёмы предварительно нагретого (43 °C) буфера D (150 мМ калийфосфата, 150 мМ NaCl) при нужных значениях pH (здесь: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 и pH 5,0) в кювету и установите температуру в держателе на 43 °C. Общий объём составляет 1 000 мкл.
5. Добавьте в буфер 12,5 мкм HdeB (или, альтернативно, тот же объём буфера хранения HdeB для управления буфером), а затем 0,5 мкм MDH. Начните мониторинг рассеяния света. Инкубировать реакцию в течение 360 секунд, чтобы обеспечить достаточное разворачивание MDH.
6. Поднимите pH до 7, добавив объём 0.16-0.34 2 M небуферизованного K_{2HPO 4} и продолжайте запись рассеяния света ещё 440 секунд.
7. Установите степень агрегации MDH, зафиксированной в отсутствие шаперона в определённый момент времени после нейтрализации (далее через 500 секунд, когда наблюдалось максимальное рассеяние света MDH), на 100%. Нормализовать активность HdeB относительно сигнала рассеяния света MDH при отсутствии HdeB при каждом указанном pH-значении.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Малатдегидрогеназа (MDH)	Рош	10127914001
Калиев фосфат (монобазический)	Fisher Scientific	BP362-500
Калийфосфат (дибазовый)	Fisher Scientific	BP363-1
Флуоресцентный спектрофотометр F-4500	Hitachi	FL25
Кюветка флуоресцентных клеток	Hellma Analytics	119004F-10-40
Соляная кислота	Fisher Scientific	A144-212
Гидроксид натрия	Fisher Scientific	BP359-500
Центробежные фильтры Amicon Ultra 30K	Миллипор	UFC803024
Хлорид натрия	Fisher Scientific	S271-10
Мембрана диализа Spectra/Por 1 MWCO: 6 кДа	Spectrum Laboratories	132650
Спектрофотометр Varian Cary 50	Agilent Tech