Оценка защитной роли кислотно-активируемого шаперона при E. coli при кислотном стрессе

Аннотация

Источник: Даль, Дж. и др. Обнаружение pH-зависимой активности Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro и in vivo. J. Vis. Exp . (2016)

В этом видео демонстрируется использование рекомбинантных культур E. coli для оценки защитного эффекта кислотно-активированного шаперона во время кислотного стресса. Мониторинг роста бактерий показывает повышенную выживаемость в культурах, экспрессирующих шапероны, по сравнению с контролем, что подчёркивает роль шаперонов в стабилизации белка при стрессовых условиях.

Протокол

1. Влияние гиперэкспрессии HdeB шаперона на выживаемость E. coli при кислотном стрессе

ПРИМЕЧАНИЕ: Геномная ДНК E. coli MG1655 была выделена по стандартному протоколу.

1. Усилить шаперон hdeB от E. coli MG1655 с помощью ПЦР с помощью праймеров hdeB-BamH, I-rev GGT, GGT, CTG, GGA TCC, TTA ATT CGG, CAA, GTC ATT и hdeB-EcoR, I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG, AAT ATT TCA TCT CTC C.
2. Настройте реакцию ПЦР в 50 мкл следующим образом: 10 мкл 5x полимеразного буфера, 200 мкМ дНТФ, 0,5 мкМ праймера JUD2, 0,5 мкМ праймера JUD5, 150 нг геномной ДНК MG1655, 0,5 мкл ДНК-полимеразы, добавьте_{ddH 2}O к 50 мкл.
3. Выполните усиление hdeB следующим образом: Шаг 1: 5 минут при 95 °C, 1 цикл; шаг 2: 30 секунд при 95 °C, 30 секунд при 55 °C, 30 секунд при 72 °C, 40 циклов; Шаг 3: 10 минут при 72 °C.
4. Клонировать полученный фрагмент ПЦР в сайты EcoRI и BamHI плазмиды pBAD18 с использованием стандартных методов клонирования рестрикционных сайтов. Очистите плазмиду с помощью комплекта для очистки плазмиды согласно инструкциям производителя. Проверьте полученную плазмиду с помощью секвенирования.
5. Преобразовать плазмид, экспрессирующий HdeB, или пустой векторный контроль pBAD18 в деформацию BB7224 (ΔrpoH) (генотип: F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn 10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺) с использованием химически компетентных клеток.
   ЗАМЕТКА: Этот штамм чувствителен к температуре.
6. После 45 секунд теплового удара при 42 °C и перед нанесением пластины инкубировать клетки при 30 °C и 200 об/мин. Проведите отдельные колониальные удаления положительных клонов и инкубируют за ночь при 30 °C. Подготовьте ночную культуру в 50 мл_{LB Amp} и культивируйте клетки при 200 об/мин и 30 °C.
7. Разбавьте за ночь культуры в 40 раз до 25 мл_{LB Amp} и выращивают бактерии в присутствии 0,5% арабинозы (Ara) при 30 °C и 200 об/мин до _O.D.600nm = 1,0, индуцируя экспрессию белка HdeB.
8. Для экспериментов с сдвигом pH используйте_{LB Amp+} Ara для разведения клеток до _O.D.600nm 0,5 и корректировки под соответствующие значения pH (здесь: pH 2,0, pH 3,0 и pH 4,0), добавляя соответствующие объемы 5 млн HCl.
9. После указанных временных точек (pH 2, 1 мин; pH 3, 2,5 мин; pH 4, 30 мин) нейтрализуйте культуры, добавляя соответствующие объемы 5 млн NaOH.
10. Мониторинг роста нейтрализованных культур в жидкой культуре в течение 12 часов при 30 °C с помощью измерений дозы.

Материалы