Экстракция геномной ДНК на основе термического лизиса из патогенной бактерии

Аннотация

Источник: Гулла, С. и др. Мультилокус с переменным числом тандем-повторный анализ рыбопатогенной бактерии Yersinia ruckeri с помощью мультиплексной ПЦР и капиллярного электрофореза. J. Vis. Exp . (2019).

Этот протокол извлекает геномную ДНК из Yersinia ruckeri , подвешивая изолированные колонии в сверхчистой воде и нагревая клетки. Центрифугирование отделяет ДНК-содержащий супернатант от клеточного мусора, создавая шаблонную ДНК, подходящую для генотипирования и эпидемиологического анализа с помощью ПЦР.

Протокол

1. Бактериальное культивирование и экстракция геномной ДНК

1. Посевайте чистые культуры Y. ruckeri на любом подходящем типе агара (авторы использовали 5% агара из бычьей крыви) и инкубируют при 22 °C в течение 1-2 дней или 15 °C в течение 3-4 дней.
2. Из каждой агарной пластины выберите одну представительную колонию с инокуляционной петлей и перенесите её в центрифугные трубки объемом 1,5 мл с 50 мкл ультраочищенной воды. Подвесить, кратковременно закрутить вихрь и инкубировать 7 минут на нагревательном блоке при 100 °C.
3. Центрифугуйте при 16 000 x g в течение 3 минут и аккуратно переместите супернатант пипеткой в пустую трубку на 1,5 мл. Переходите к следующему этапу, используя супернатант в качестве шаблонной ДНК или храните при -20 °C до этого времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инкубатор 22°C/15°C	Как хотите.	NA
Центрифуга(и)	Как хотите.	NA
Трубы с безопасным замком Eppendorf, 1,5 мл	Эппендорф	30120086	Центрифугные трубки, используемые при извлечении ДНК.
Морозилка	Как хотите.	NA
Нагревательный блок	Как хотите.	NA
Вода Milli-Q	NA	NA	Очищенная вода, используемая при ПЦР и капиллярном электрофорезе. Стандартный рецепт; производится внутри компании.
Чистая культура Yersinia ruckeri	NA	NA	Например, криоконсервированный или свежий.
Vortexer	Как хотите.	NA