В этом видео демонстрируется процедура разделения флуоресцентно маркированных тандемных повторов с переменным числом (VNTR), полученных из патогенной бактерии рыб, с использованием капиллярного электрофореза для создания профилей электроферограммы, специфичных по размеру, для идентификации бактерий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение патогенов рыб с помощью анализа тандемных повторов с переменным числом (VNTR)
432 просмотров
⸱
28 ноября 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
1. Установка и условия работы капиллярного электрофореза
- После подтверждения ПЦР (полимеразной цепной реакции) ампликонов разбавьте продукты ПЦР в соотношении 1:10 (в/в) в очищенной воде. Запечатать, смешать и ненадолго центрифугировать.
- Работая в шкафу с дымом, приготовьте объём мастер-смеси, состоящий из 9 мкл формамида и 0,5 мкл стандартного размера на каждый продукт ПЦР (допускайте 10% избыточного объёма). Кратковременно распределите 9,5 мкл в колодцы на пластине, подходящей для доступной системы CE (капиллярный электрофорез), после чего добавьте 0,5 мкл разбавленной ПЦР-системы. Запечатать, смешать и ненадолго центрифугировать.
ОСТОРОЖНОСТЬ: Обращайтесь осторожно. Смешивание формамида с водой образует муравьиную кислоту, которая токсична. - С помощью ПЦР-термического циклера денатурируйте образцы при 95 °C в течение 3 минут, а затем охладите до 4 °C бесконечно. Кратко центрифугуйте и загрузите пластину на откалиброванную систему CE согласно инструкциям производителя.
- Провести анализ фрагментов CE с использованием реагентов в зависимости от выбранного аппарата и при следующих настройках: 60 °C; инъекции на 5 с при 1,6 кВ (32 В на см); 32 минуты работы при 15 кВ (300 В на см). Анализ CE-фрагментов 24 скважины на 24-капиллярном (50 см) обычно занимает примерно 50 минут.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Генетический анализатор Avant 3500xL | Термо Фишер Сайентифик | A30469 | Используется для анализа фрагментов капиллярного электрофореза. |
| Модули BioNumerics7 | Прикладная математика | NA | Используется для генерации минимальных остовенных деревьев из данных MLVA. |
| Центрифуга(и) | Как хотите. | NA | |
| Трубы с безопасным замком Eppendorf, 1,5 мл | Эппендорф | 30120086 | Центрифугные трубки, используемые при извлечении ДНК. |
| Морозилка | Как хотите. | NA | |
| Шкаф с дымом | Как хотите. | NA | |
| Программное обеспечение GeneMapper 5 | Термо Фишер Сайентифик | 4475073 | Используется для чтения электроферограмм при капиллярном электрофорезе. |
| GeneScan 600 LIZ Size Size Standard v2.0 | Термо Фишер Сайентифик | 4408399 | Стандарт размера, используемый при капиллярном электрофорезе. |
| Hi-Di Formamide | Термо Фишер Сайентифик | 4311320/4440753 | Деионизированный формамид, используемый при капиллярном электрофорезе. Готовьте рабочие аликуаты. |
| Вода Milli-Q | NA | NA | Очищенная вода, используемая при ПЦР и капиллярном электрофорезе. Стандартный рецепт; производится внутри компании. |
| Мультиплексный комплект PCR Plus | Цягэн | 206151/206152 | |
| ПЦР-термический циклер | Как хотите. | NA | |
| Полимер POP-7 для генетических анализаторов Dx 3500 Dx/3500xL | Термо Фишер Сайентифик | A26077/4393713/4393709 | Матрица разделения, используемая при капиллярном электрофорезе. |
| Чистая культура Yersinia ruckeri | NA | NA | Например, криоконсервированный или свежий. |
| Вода без РНазы | Цягэн | NA | В: комплект Multiplex PCR Plus |
| Буфер Tris-borate-EDTA (TBE) | NA | NA | Стандартный рецепт; производится внутри компании. |
| Трипсин соевый агар/агар из бычьей крови | NA | NA | Стандартный рецепт; производится внутри компании. |
| Vortexer | Как хотите. | NA |
