Обнаружение патогенов рыб с помощью анализа тандемных повторов с переменным числом (VNTR)

Abstract

Источник: Гулла, С. и др. Мультилокус с переменным числом тандем-повторный анализ рыбопатогенной бактерии Yersinia ruckeri с помощью мультиплексной ПЦР и капиллярного электрофореза. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется процедура разделения флуоресцентно маркированных тандемных повторов с переменным числом (VNTR), полученных из патогенной бактерии рыб, с использованием капиллярного электрофореза для создания профилей электроферограммы, специфичных по размеру, для идентификации бактерий.

Protocol

1. Установка и условия работы капиллярного электрофореза

1. После подтверждения ПЦР (полимеразной цепной реакции) ампликонов разбавьте продукты ПЦР в соотношении 1:10 (в/в) в очищенной воде. Запечатать, смешать и ненадолго центрифугировать.
2. Работая в шкафу с дымом, приготовьте объём мастер-смеси, состоящий из 9 мкл формамида и 0,5 мкл стандартного размера на каждый продукт ПЦР (допускайте 10% избыточного объёма). Кратковременно распределите 9,5 мкл в колодцы на пластине, подходящей для доступной системы CE (капиллярный электрофорез), после чего добавьте 0,5 мкл разбавленной ПЦР-системы. Запечатать, смешать и ненадолго центрифугировать.
   ОСТОРОЖНОСТЬ: Обращайтесь осторожно. Смешивание формамида с водой образует муравьиную кислоту, которая токсична.
3. С помощью ПЦР-термического циклера денатурируйте образцы при 95 °C в течение 3 минут, а затем охладите до 4 °C бесконечно. Кратко центрифугуйте и загрузите пластину на откалиброванную систему CE согласно инструкциям производителя.
4. Провести анализ фрагментов CE с использованием реагентов в зависимости от выбранного аппарата и при следующих настройках: 60 °C; инъекции на 5 с при 1,6 кВ (32 В на см); 32 минуты работы при 15 кВ (300 В на см). Анализ CE-фрагментов 24 скважины на 24-капиллярном (50 см) обычно занимает примерно 50 минут.

Materials