Подвержение синтетическому оральному бактериальному сообществу имитации фаз пищеварения

Аннотация

Источник: Arroyo, M. C. и др. Оценка жизнеспособности синтетического бактериального консорциума на интерфейсе кишечника-хозяина in vitro . J. Vis. Exp . (2018)

Это видео демонстрирует оценку жизнеспособности синтетического перорального микробного сообщества во время имитации орального, желудочного и кишечного пищеварения. Выживаемость бактерий измеряется после каждой фазы, показывая постепенное снижение из-за пищеварительного стресса.

Протокол

1. Выживаемость бактерий после прохождения в in vitro желудочно-кишечных транзитных условий

ЗАМЕТКА: Приготовьте имитированные пищеварительные жидкости с помощью описанных ниже модификаций. Приготовьте все разбавления с ультрачистой водой. Фильтруйте-стерилизуйте все растворы через фильтр 0,22 мкм и выполняйте процедуру переваривания в стерильных условиях.

1. Пероральное пищеварение:
   1. Поместите 3 мл бактериального сообщества в стерильную трубку объёмом 50 мл, смешайте с 3 мл имитированной слюнной жидкости (SSF), содержащей в миллимолях на литр (ммоль L⁻¹): хлорид калия (KCl), 15,1; Монокалиев фосфат (KH₂PO₄), 3,7; Бикарбонат натрия (NaHCO₃) — 6,8; Гексагидрат хлорида магния (MgCl₂·6H₂O), 0,5, карбонат аммония [(NH₄)₂CO₃], 0,06; Соляная кислота (HCl) — 1.1; Хлорид кальция (CaCl₂·2H₂O) — 0,75. Добавьте 75 U/mL α-амилазы из слюны человека типа IX-A и 2 г/л слизи из желудка свинины (тип II) в SSF.
   2. Инкубировать смесь в течение 2 минут при 37 °C и 100 об/мин. Возьмите образец объёмом 2 мл для экстракции ДНК и количественной оценки потоковой цитометрии (S1).

2. Желудочное пищеварение:

1. Добавьте 4 мл имитированной желудочной жидкости (SGF), содержащей (в ммоле L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; NaHCO₃, 25 лет; Хлорид натрия (NaCl) — 47,2; MgCl₂·6H₂O, 0,1, (NH₄)₂CO₃, 0,5; HCl — 15,6; CaCl₂·2H₂O, 0,075. Кроме того, в SGF содержалось 2 г/л слизи из желудка свинины (тип II).
2. Измерьте pH и отрегулируйте до pH 3 с помощью 1 молярного (1 M) HCl, если потребуется. Инкубировать при 37 °C и 100 об/мин. Возьмите образец объёмом 2 мл (S2).

3. Пищеварение тонкой кишки:

1. Добавьте 4 мл имитированной кишечной жидкости (SIF), содержащей (в мол L-1): KCl — 6,8; KH₂PO₄, 0,8; NaHCO₃ — 85; NaCl — 38,4; MgCl₂·6H₂O, 0,33; HCl — 8,4; CaCl₂·2H₂O, 0,3, в пищеварительную трубку.
2. При необходимости отрегулируйте pH 7 с 1 M гидроксида натрия (NaOH). Инкубировать при 37 °C и 100 об/мин. Возьмите образец объёмом 2 мл (S3).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Муцин из свиного желудка типа II	Сигма-Олдрич	M2378
PBS	Gibco	14190250
Millipore Milli-Q академическая, ультрачистая водная система	Миллипор, Merck KGaA	-
Инкубаторный шейкер InnOva 4080	Нью-Брансуик Сайентифик	8261-30-1007
Вода без нуклеазы	Серва-электрофорез	28539010
Потоковый цитометр BD Accuri C6	BD Biosciences	653118
Комплект InnuPREP PCRpure	Аналитик Йена	845-KS-5010250	Набор для очистки ПЦР