Извлечение геномной ДНК из тканей листьев растений, инфицированных патогенными бактериями

Аннотация

Источник: Гулла, С. и др. Мультилокус с переменным числом тандем-повторный анализ рыбопатогенной бактерии Yersinia ruckeri с помощью мультиплексной ПЦР и капиллярного электрофореза. J. Vis. Exp . (2019).

Этот протокол извлекает геномную ДНК из Yersinia ruckeri , подвешивая изолированные колонии в сверхчистой воде и нагревая клетки. Центрифугирование отделяет ДНК-содержащий супернатант от клеточного мусора, создавая шаблонную ДНК, подходящую для генотипирования и эпидемиологического анализа с помощью ПЦР.

Протокол

1. Бактериальное культивирование и экстракция геномной ДНК

1. Посевайте чистые культуры Y. ruckeri на любом подходящем типе агара (авторы использовали 5% агара из бычьей крыви) и инкубируют при 22 °C в течение 1-2 дней или 15 °C в течение 3-4 дней.
2. Из каждой агарной пластины выберите одну представительную колонию с инокуляционной петлей и перенесите её в центрифугные трубки объемом 1,5 мл с 50 мкл ультраочищенной воды. Подвесить, кратковременно закрутить вихрь и инкубировать 7 минут на нагревательном блоке при 100 °C.
3. Центрифугуйте при 16 000 x g в течение 3 минут и аккуратно переместите супернатант пипеткой в пустую трубку на 1,5 мл. Переходите к следующему этапу, используя супернатант в качестве шаблонной ДНК или храните при -20 °C до этого времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для очистки геномной ДНК Wizard	Promega	A1120	Источник растворов для лизисирования ядер, РНаз, белковой преципитации и растворов для регидратации ДНК
Жидкий азот	Воздушные продукты	Н/Д
Mastercycler pro с панелью управления	Эппендорф	6321000019
1250 Вт микроволновая волна	Panasonic	Н/Д
Настольная центрифуга 5424	Эппендорф	05-403-93
Цифровая водяная баня Isotemp 215	Фишер Сайентифик	15-462-15Q
Металлическая лопатка	Сигма-Олдрич	Z283274
Ступка с пестиком	Сигма-Олдрич	Z247464
LSE Vortex Mixer	Корнинг	6775
2-пропанол	Сигма-Олдрич	I9516
Стерильные наконечники 10 мкл	TipOne	1161-3730
Стерильные наконечники на 200 мкл	TipOne	1163-1730
Стерильные наконечники 1250 мкл	TipOne	1161-1750
Набор для пипетторов с переменным объёмом	VWR	75788-460
Этидий бромид	Сигма-Олдрич	E1510
Агароза	IBI Scientific	IB70041
ЭДТА	Термо Фишер Сайентифик	17892
Уксусная кислота	Фишер Кемикал	A38-212
База Трис	Сигма-Олдрич	10708976001
μcuvette	Эппендорф	6138000018
Базис биоспектрометра	Эппендорф	6135000009