Мягкий агаровый наложенный анализ для обнаружения бактериоцино-опосредованного уничтожения у сирингов Pseudomonas

Аннотация

Источник: Хокетт, К. Л., и Балтрус, Д. А. Использование техники мягкого наложения агаром для скрининга бактериально продуцируемых ингибирующих соединений. J. Vis. Exp .(2017)

В этом видео демонстрируется процедура обнаружения убийства, опосредованного бактериоцином, путем выделения супернатанда из антибиотико-индуцированного донорского штамма на мягкий агар, содержащий тестовый штамм. Прозрачные зоны, образующиеся после инкубации, указывают на торможение бактерий.

Протокол

1. Подготовка наложения и тестирование супернатантов для активности

1. Инокуляция одной колонии штамма P. syringae для проверки чувствительности в 3 мл KB (среда King's B), инкубировать на ночь с встряхиванием при комнатной температуре.
2. На следующее утро разведите культуру на 1/100 до свежего KB. Инкубировать 3-4 часа с встряхиванием при комнатной температуре.
3. Подготовьте стерилизованный водяной агар, автоклавировав суспензию 0,35-0,7% агара в сверхчистой воде.
   ЗАМЕТКА: Запас мягкой водяной агара можно растопить в микроволновке и многократно использовать; Для каждого эксперимента не нужно готовить новый наложение. Если водный агар используется повторно, крайне важно полностью расплавить его после разогрева в микроволновке. Если нет, то после затвердевания наложение будет иметь зернистую текстуру, что затруднит интерпретацию.
4. Перед использованием храните расплавленный мягкий агар в водяной бане при температуре 60 °C. Используя стерильную серологическую пипетку, перенесите 3 мл мягкого агара в стерильную культурную трубку. Верните культивационную трубку в водяную ванну, чтобы сохранить расплавленное состояние.
5. Чтобы налить наложение, сначала дайте расплавленному агару остыть (он должен быть тёплым, но не горячим на ощупь), но не дайте ему затвердеть.
6. В стерильном капюшоне инокуляция 100 мкл культуры тестера в мягкий агар и вихрь для смешивания. Поварите культуру вручную 10-15 секунд, затем вылейте на дно агар (KB agar). Наклоните пластину во все стороны, чтобы мягкий агар равномерно покрывал нижний агар.
   ЗАМЕТКА: Нижний агар может быть любой затвердевшей (1,5% агар) среды, на которой интенсивно растёт тестовый штамм. Для стандартной чашки Петри диаметром 100 мм используйте ~20 мл расплавленной среды. Нижний агар можно подготовить за несколько недель до срока (если поддерживать при 4 °C без сушки) или в тот же день.
7. Накройте тарелку и дайте ей затвердеть на 20-30 минут. Будьте осторожны, чтобы не потревожить пластину, пока она затвердевает.
8. После затвердевания нанесите на накладку 2-5 мкл супернатанта. Дайте тарелкам инкубировать ночь при комнатной температуре. Наблюдайте и фиксируйте результаты на следующее утро.
   ЗАМЕТКА: Может быть полезно проводить и выявлять из последовательного разбавления супернатанта. Это позволит исследователям различать активность очищения бактериофагов и бактериоцинов. В этом случае рекомендуется проводить разбавление в соотношении 1:5 или 1:10.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Митомицин C	Санта-Крус Биотехнология	SC-3514	Канцерогенный. Используйте соответствующие средства защиты (например, перчатки, защиту для глаз и маску), особенно при приготовлении стандартного раствора.
Агар бактериологического класса	Genesee Scientific	20-274