Выделение бактерий, адаптированных к стрессу, посредством отбора в одну колонию

Аннотация

Источник: Jeong, H., и др. Процедура адаптивной лабораторной эволюции микроорганизмов с использованием хемостата. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео демонстрируется селективная изоляция и рост бактерий, адаптированных к стрессу, из культуры, подвергшейся длительному стрессу. Культура покрывается на агаре, содержащем стрессоры, и выбирается одна колония для инокуляции жидкой среды этим стрессом. Поглощение измеряется с регулярными интервалами для мониторинга роста и подтверждения успешной изоляции бактерий, адаптированных к стрессу.

Протокол

1. Подготовка оборудования

1. Возьмите банку с хемостатом (150-250 мл) или колбу Эрленмайера (250 мл) с входным и выходным портом. Соединяйте порты кремниевой трубкой, обеспечивая расход от 10 до 100 мл/ч. По возможности используйте вентиляционный отверстие, выход воздуха и входные и выходные порты с контролируемой температурой.
2. Приобретите устройство, подходящее для банки с хемостатом, которое обеспечивает перемешивание и контроль температуры (или используйте вращательный встряхивающий инкубатор).
3. Приобретите два перистальтических насоса для подачи свежей среды и сбора культуры.
4. Получите резервуарную банку (10-20 л) с средним выходным и воздухозаборным отверстием.
5. Получить кремниевую трубку, подходящую для скорости разбавления (то есть ID 0,8 мм, диапазон потока 0,06-36 мл/мин; Трубка L/S 13).

2. Средняя подготовка и стерилизация

1. Начальная среда
   1. Растворить 0,3 г глюкозы, 0,08 г хлорида аммония (_{NH 4}Cl), 0,05 г хлорида натрия (NaCl), 0,75 г дигидрата дигидрата динатрия-фосфата (Na₂HPO₄·2H₂O) и 0,3 г дигидрата динотрия гидрофосфата (KH₂PO₄) в дистиллированной воде объёмом 90 мл (D.W.) в банке для хемостат.
   2. Герметизируйте банку с хемостатом вместе с трубками с помощью зажимов. Не герметизируйте вентиляционный отверстие.
   3. Стерилизуйте банку с хемостатом в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. После стерилизации храните банку с хемостатом при комнатной температуре.
   4. Растворить 0,02 г сульфат магния гептагидрата (MgSO₄·7H₂O), 0,01 г хлорида кальция (_{CaCl 2}) и 0,1 мг тиамина в 10 мл ДВ (раствор A).
   5. Фильтруйте раствор A с помощью шприца и предварительно стерилизованного шприцового фильтра (поровый фильтр 0,45 мкм).
   6. Добавьте раствор фильтрата в банку с хемостатом.
2. Среда напряжения
   1. Растворить 30 г глюкозы, 8 г_{NH 4}Cl, 5 г NaCl, 75 г Na₂HPO₄·2H₂O, 30 г KH₂PO₄ и 300 г гексагидрат сукцината динатрия (_{Na 2}·сукцинат·6H₂O; стрессор, использованный в этом эксперименте) в 9,9 л ДВ в резервуарной банке.
   2. Герметизируйте банку с резервуаром вместе с трубками с помощью зажимов. Не герметизируйте вентиляционный отверстие.
   3. Стерилизуйте банку с резервуаром в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. После стерилизации храните банку при комнатной температуре.
   4. Растворить 2 г MgSO₄·7H₂O, 1 г CaCl₂ и 10 мг тиамина в 100 мл раствора D.W. (раствор A).
   5. Фильтрующий раствор A с помощью шприца и предварительно стерилизованного шприцового фильтра (поровый фильтр 0,45 мкм).
   6. Добавьте раствор фильтрата A в резервуарную банку.
   7. Асептически подключите стерилизованную кремниевую трубку к резервуарной банке и подключите перистальтические насосы.
3. Среда с высоким стрессом
   1. Подготовьте среду, как в разделе 2.2, но с большей концентрацией стрессора (то есть на 3-5 г/л выше сукцинатной адаптации).
      Примечание: Этот протокол предназначен для адаптации к стрессу, который может быть выдан через среду. В случае физических стрессовых факторов, таких как температура, волнение или освещение, культивация должна быть спроектирована соответственно.

3. Начальное культивирование

1. Инокулировать одну колонию дикого типа Escherichia coli (E. coli) в пробирку объемом 15 мл с 4 мл начальной среды.
2. Инкубировать пробирку в встряхивающем инкубаторе 12 часов при 37 °C и 220 об/мин.
3. Асептически перенесите 1 мл прекультуры в банку для хемостат.
4. Инкубировать банку с хемостатом, обеспечивая аэрацию (воздух 50 мл/мин) и перемешивание (200 об/мин) при 37 °C в течение 6 часов.

4. Адаптация к стрессу

1. Асептически соедините конец силиконовой трубки от насосов к банке для хемостата.
2. Запустите выходной насос (10 мл/ч или выше) и собирайте культуру. Примечание: культура должна находиться в экспоненциальной фазе, обычно через 4-8 часов после начальной культивации.
3. Проверьте оптическую плотность (600 нм) культуры из выходной трубки.
4. Запустите впускной насос (10 мл/ч, что соответствует скорости разбавления 0,1 ч-1).
5. Проверяйте оптическую плотность культуры на 600 нм от выходной трубки каждые 24 часа.
6. Используйте хемостат 96 часов (оборот в 9,6 раза) и более. Если оптическая плотность стабильна, замените резервуар, содержащий среду высокого напряжения. Если оптическая плотность ниже 0,2, остановите подачный насос на 6 часов. Перезагрузите впускной насос и проверьте, что оптическая плотность превышает 0,2.
7. Постепенно увеличивайте концентрацию стрессора, переходя на резервуар с более высокой концентрацией стрессора.
8. Берите образцы адаптированной культуры, когда она достигает определённого этапа (например, штамм, адаптированный к стрессу 100 г/л), и храните их для дальнейшего геномного анализа.
9. Для хранения образцов смешайте образец культуры (0,5 мл) с стерильным раствором 80% глицерина (0,5 мл) и храните при -80 °C. Примечание: если микроорганизм приобретает способность разлагать стрессор в процессе ALE, концентрация стрессона в банке для ферментации отличается от концентрации в свежем резервуаре.

5. Изоляция штамма, адаптированного к стрессу в одной колонии

1. Приготовьте среду для агарной пластины (1,6% агар), содержащую тот же стрессор и с той же концентрацией среды.
2. Выложите выходную культуру (0,1 мл) из хемостата и инкубуйте при 37 °C в течение 16 часов.
3. Выберите отдельные колонии из пластины стерильной зубочисткой и инкуляцируйте их в пробирках объёмом 15 мл с тем же стрессом и с той же средней концентрацией, что и в хемостате, и инкубировать в течение 6 часов.
4. Перелите 1 мл культурного бульона в колбу Эрленмайера объемом 250 мл, содержащую 50 мл среды. Собирайте 0,5 мл культурного бульона каждые 1 час и измеряйте дозу 600 нм. Сравните скорость роста адаптированного штамма с ростом дикого типа с учётом стрессора.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ферментатор мини-хемостат	Biotron Inc.	-	Производилось по специальному заказу
Кремниевые трубки	Коул-Пармер	Masterflex L/S 13	Размер трубок может варьироваться в зависимости от скорости разбавления и размера банка ферментатора.
Резервуарная банка	Bellco	Бутылка для хранения носителей	20 L
Химикалии	Сигма-Олдрич	-	Степень реагента
Глюкоза	Сигма-Олдрич	G5767	Реагент ACS
NH₄Cl	Сигма-Олдрич	A9434	для молекулярной биологии, подходит для культивирования клеток — ≥99,5%
NaCl	Сигма-Олдрич	746398	Реагент ACS, ≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	Сигма-Олдрич	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	Сигма-Олдрич	795488	Реагент ACS, ≥99%
MgSO₄·7H₂O	Сигма-Олдрич	230391	Реагент ACS, ≥98%
CaCl₂	Сигма-Олдрич	793639	Реагент ACS, ≥96%
Тиамин·HCl	Сигма-Олдрич	T4625	Реагентная степень, ≥99%.
Na₂succinate·6H₂O	Сигма-Олдрич	S2378	ReagentPlus, ≥99%