1. Сбор и хранение воды и кораллов для микробной изоляции
ЗАМЕТКА: Важно учитывать координаты и температуру мест отбора проб. Если возможно, метаданные, такие как солёность, pH, глубина и интенсивность света, также могут помочь в поиске тонко отточенных подходов к культивации и будущей интерпретации данных. Для надёжных результатов храните образцы максимально возможного времени. Микробиомы воды и кораллов могут значительно измениться, если образцы хранятся при правильной температуре и/или хранятся длительное время. Если этап изоляции не выполняется мгновенно после сбора, крайне важно поддерживать образцы при температуре 4 °C до обработки. Чем дольше образцы хранятся, даже при 4 °C, тем сильнее меняется микробное сообщество.
- Пробуйте и храните морскую воду.
- Соберите образцы воды не менее чем в три экземпляра с каждого целевого участка отбора. Желательно использовать стерильные бутылки с винтовыми крышками.
- Если воду обрабатываете сразу после сбора, оставьте бутылки на RT на короткое время. Если обработка образца будет происходить позже, держите бутылки при температуре 4 °C.
- Попробуйте и храните кораллы.
- Используйте стерильные плоскогубцы, чтобы вырезать фрагменты кораллов из того же места отбора проб воды. Чтобы избежать загрязнения, касайтесь кораллов только стерильными перчатками.
- Промывайте отобранный фрагмент коралла с помощью 20 мл стерильного солевого раствора (3% NaCl в дистиллированной воде) или искусственной морской воды, чтобы избавиться от свободно прикреплённых свободно живущих бактерий из морской воды.
- С помощью щипцов поместите каждый фрагмент коралла в стерильный контейнер объёмом 250−500 мл с винтовой крышкой, содержащей стерильный физиологический раствор.
- В лаборатории, используя стерильные щипцы и плоскогубцы, взвешивают 5 г фрагментов кораллов с использованием стерильных чашек Петри размером 100 мм x 20 мм на весах.
- Переложите 5 г образца кораллов в стерильную ступку и нажмите с помощью стерильного пестика.
- Используя стерильную лопатку, переместите макерированный образец в стерильную культурную колбу с 45 мл 3% раствора NaCl и 10−15 стеклянными шариками диаметром 5 мм. Используйте немного стерильного физиологического раствора объемом 45 мл, чтобы промыть раствор и восстановить максимальное количество макерата.
- Держите колбы под постоянным перемешиванием (150 х г) в течение 16 часов при температуре воды на месте отбора проб.
ЗАМЕТКА: Для мелководных кораллов оптимальная температура будет от 24−28 °C. Этот этап отделит микроорганизмы от различных коралловых компартментов, таких как те, что прикреплены к клеткам хозяина, или те, что живут внутри ткани и скелета. После этого этапа коралловые мацераты не следует хранить, и этап изоляции должен быть выполнен немедленно.
2. Выделение синтетических бактерий эстрогена-17а-этинилэстрадиолила (EE2), разлагающих их из морской воды и/или кораллов
- Выберите бактерии.
ЗАМЕТКА: После шагов 1.1.2 и 1.2.7 концентрация микроорганизмов в морской воде, отделившихся от различных коралловых мацератов, будет неизвестна и будет переменной. Для обеспечения изоляции отдельных микробных колоний в чашках Петри, содержащих агарную среду, требуются серийные разбавления.- Проведите последовательные разбавления до 10-9 в стерильном солевом растворе для образцов кораллов и до 10-6 для водных образцов. Пипетка разбавляет вверх-вниз 5 раз, прежде чем выбрасывать кончик. Вихрь проводит сэмплы в течение 5 секунд каждый раз перед следующим последовательным разбавлением.
- Пипетить 100 мкл каждого разбавления на чашках Петри с 3% агара из бульона лизогенезии NaCl (LB) и выложить их на тарелку.
ЗАМЕТКА: Используйте морской агар (MA) в качестве альтернативного средства. Для надёжных результатов требуется тройное разбавление каждого разбавления. - Инкубировать пластины в течение 1−3 дня при целевой температуре (например, 26 °C). Проверяйте номера раз в день.
- Выберите и изолируйте колонии с отличительной морфологией роста на новых пластинах с помощью техники полосатых пластин. Повторяйте этот шаг столько раз, сколько потребуется, чтобы на пластинах расти чистые колонии.
- Если процедуру немедленно не продолжить по шагу 2.3.1, изоляты храните при 4 °C или в глицероле, как описано в разделе 2.2.
- Приготовьте глицероловые бульоны.
ЗАМЕТКА: Этот этап является необязательным и может использоваться для длительного хранения бактериальных запасов.- Выбирайте отдельные колонии из свежей пластины или с пластин, хранящихся при 4 °C, и независимо инокулируйте их в 2 мл стерильной LB среды.
- Устанавливайте трубки под постоянным перемешиванием (150 x g) при 24−28 °C ночью (ON).
- Добавьте 1 мл бактериальных культур из шага 2.2.2 и стерильный глицерин до конечной концентрации 20% к 2 мл криовиал.
- Оставьте криовиалы включёнными при 4 °C.
- Размещайте бактериальные бульи с глицерином при -80 °C до необходимости.
- Проведите тест на деградацию EE2.
- Активируйте изоляты в бульоне LB или в альтернативных средах. Для этого выберите одну колонию из свежих пластин или из пластины, хранящейся при 4 °C, и инокулируйте 2 мл стерильной LB среды. Если это глицероловый запас, сначала нанесите его на пластины LB агаров и инкубуйте при температуре 24−28 °C ON, чтобы расти отдельные колонии. Поставьте трубку с наклонённой низкой средой при постоянном перемешивании (150 x g) при 24−28 °C ON.
- После роста бактерий пеллетуйте клетки, центрифугая их при 8 000 x g в течение 8 минут при комнатной температуре (RT). Сбросьте супернатант и, аккуратно поднимая и опуская пипетом, снова суспензируйте клетки в равном объёме (2 мл) физиологической воды, чтобы промыть оставшийся бульон LB.
- Повторите шаг 2.3.2 дважды, чтобы убедиться, что не осталось следов источника углерода, и ячейки снова суспензируются в равном объёме солевого раствора. Например, если его начали с культуры объёмом 2 мл, клетки снова суспензируются в финальном объёме физиологического раствора 2 мл.
- Инокулировать промытые и вновь взвешенные клетки в минимальную культурную среду Bushnell Haas (BH Broth), содержащую EE2 как единственный источник углерода.
ЗАМЕТКА: EE2 растворяется в этаноле при конечной концентрации 5 мг/л в культурной среде. При необходимости изменяйте тип и/или концентрацию загрязняющих веществ. - Оценивайте рост бактерий по оптической плотности на 600 нм и/или формировании колоний (CFU) на среде LB агарной среды в течение 16−72 часа инкубации.
ЗАМЕТКА: В качестве альтернативы микроорганизмы могут быть напрямую выделены на минимальной среде, содержащей EE2 или другие соединения как единственный источник углерода. Этот шаг направляет отбор и предотвращает нежелательный рост.