Селективное обогащение и изоляция морских бактерий, разлагающих нефть, из образцов морской воды

Аннотация

Источник: Виллела, Х. Д. М . и др. Поиск микробных штаммов для биоремедиации и разработки пробиотиков для исследований и сохранения метаорганизмов. J. Vis. Exp . (2019)

В этом видео демонстрируется селективная изоляция морских бактерий, разрушающих нефть, путём обогащения образцов морской воды на нефтяной среде, что позволяет извлекать чистые штаммы с потенциальным применением в биоремедиации сырой нефти и очистке окружающей среды.

Протокол

1. Сбор и хранение воды и кораллов для микробной изоляции

ЗАМЕТКА: Важно учитывать координаты и температуру мест отбора проб. Если возможно, метаданные, такие как солёность, pH, глубина и интенсивность света, также могут помочь в поиске тонко отточенных подходов к культивации и будущей интерпретации данных. Для надёжных результатов храните образцы максимально возможного времени. Микробиомы воды и кораллов могут значительно измениться, если образцы хранятся при правильной температуре и/или хранятся длительное время. Если этап изоляции не выполняется мгновенно после сбора, крайне важно поддерживать образцы при температуре 4 °C до обработки. Чем дольше образцы хранятся, даже при 4 °C, тем сильнее меняется микробное сообщество.

1. Пробуйте и храните морскую воду.
   1. Соберите 500 мл водных образцов не менее чем в три экземпляра с каждого целевого участка отбора. Желательно использовать стерильные бутылки с крышками на винтовые крышки.
   2. Если воду обрабатывают сразу после сбора, держать бутылки при RT (комнатной температуре) на короткое время. Если обработка образца будет происходить позже, держите бутылки при температуре 4 °C.
2. Попробуйте и храните кораллы.
   1. Используйте стерильные плоскогубцы, чтобы вырезать фрагменты кораллов из того же места отбора проб, где берутся водные образцы. Чтобы избежать загрязнения, касайтесь кораллов только стерильными перчатками.
   2. Промыйте пробный фрагмент коралла с помощью 20 мл стерильного солевого раствора (3% NaCl (хлорида натрия) в дистиллированной воде) или искусственной морской воды, чтобы избавиться от слабо прикреплённых свободно живущих бактерий из морской воды.
   3. С помощью щипцов поместите каждый фрагмент коралла в стерильный контейнер объёмом 250−500 мл с винтовой крышкой, содержащей стерильный физиологический раствор.
   4. В лаборатории, используя стерильные щипцы и плоскогубцы, взвешивают 5 г фрагментов кораллов с использованием стерильных чашек Петри размером 100 мм x 20 мм на весах.
   5. Переложите 5 г образца кораллов в стерильную ступку и нажмите с помощью стерильного пестика.
   6. Используя стерильную лопатку, переместите макерированный образец в стерильную культурную колбу с 45 мл 3% раствора NaCl и 10−15 стеклянными шариками диаметром 5 мм. Используйте немного стерильного физиологического раствора объемом 45 мл, чтобы промыть раствор и восстановить максимальное количество макерата.
   7. Держите колбы под постоянным перемешиванием (150 х г) в течение 16 часов при температуре воды на месте отбора проб.
      ЗАМЕТКА: Для мелководных кораллов оптимальная температура будет от 24−28 °C. Этот этап отделит микроорганизмы от различных коралловых компартментов, таких как те, что прикреплены к клеткам хозяина, или те, что живут внутри ткани и скелета. После этого этапа коралловые мацераты не следует хранить, и этап изоляции должен быть выполнен немедленно.

2. Изоляция бактерий, разлагающих масло, из морской воды и/или кораллов

1. Подготовьте минимальную среду, содержащую водорастворимую фракцию масла (oWSF) и нефтяную нерастворимую фракцию (oWIF) в качестве единственного источника углерода.
   1. Добавьте 1−2% сырого масла в 500 мл стерильной дистиллированной воды. Используйте фильтрующую колбу, открытую снизу, чтобы удалить растворимую фракцию, не трогая верхний слой нерастворимой фракции.
   2. Поддерживайте смесь в постоянном перемешивании при 24−28 °C при 150 x g в течение 48 часов.
   3. Поместите фильтровую колбу с фракциями сырой нефти на устойчивую поверхность и подождите 10−20 минут, чтобы обеспечить разделение растворимых и нерастворимых фракций.
   4. Перенесите oWSF в новую стерильную колбу, сохранив oWIF, открыв нижний фильтр и убрав растворимую фракцию.
   5. Используя весь oWSF, полученный на предыдущем этапе (~400 мл), подготовьте 1 л минимальной среды BH (Bushnell Haas) агара, содержащего oWSF как единственный источник углерода.
   6. Используя оставшийся в колбе oWIF из шага 2.1.4, подготовьте 1 л минимальной среды BH агара, содержащего oWIF как единственный источник углерода.
2. Изолировать бактерии, разрушающие WSF и oWIF.
   1. Используя воду и коралловый мацерат из шагов 1.1.2 и 1.2.7 соответственно, разбавьте образцы до ^10-6 в стерильном солевом растворе, как указано ниже.
3. Проведите последовательные разбавления до ^10-9 в стерильном солевом растворе для образцов кораллов и до ^10-6 для водных образцов. Пипетка разбавляет вверх-вниз 5 раз, прежде чем выбрасывать кончик. Вихрь проводит сэмплы в течение 5 секунд каждый раз перед следующим последовательным разбавлением.
4. Пипетте 100 мкл каждого разбавления на чашках Петри, содержащие агарные среды BH-oWSF и BH-oWIF, и выкладывают их на тарелки.
5. Инкубировать пластины в течение 1−3 дня при целевой температуре (например, 26 °C). Проверяйте номера раз в день.
6. Выберите и изолируйте колонии с отличительной морфологией роста на новых пластинах с помощью техники полосатых пластин. Повторяйте этот шаг столько раз, сколько потребуется, чтобы на пластинах расти чистые колонии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бутылка для хранения носителей PYREX объемом 500 мл	Томас Сайентифик/Корнинг	1743E20/1395-500	Используется для проб воды.
Аспираторные бутылки объемом 500 мл	Томас Сайентифик/Корнинг	1234B28/1220-2X	Используется для разделения нефтяных долей.
Плоскогубцы для резки проволоки диаметром 6 дюймов	Томас Сайентифик/Рестек	1173Y64/23033	Используется для вырезания фрагментов кораллов.
Агар	Himedia	PCT0901-1KG	Использовался для производства твёрдых носителей.
Бульон Бушнелл Хаас	Himedia	M350-500G	Используется как минимальная среда для дополнения источниками углерода.
Колба Эрленмайера	Томас Сайентифик/DWK Life Sciences (Кимбл)	4882H35/26500-125	Используется для инкубации коралловой мацерации стеклянными бусинами.
Ламинарная вытяжка			Нужно было работать в стерильных условиях.
Бульон Лурия Бертани, Миллер (Бульон Миллер Луриа Бертани)	Himedia	M1245-1KG	Используется как богатая среда для выращивания бактерий.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)	Himedia	M384-500G	Используется как богатая среда для выращивания бактерий.
Орбитальный встряхивающий инкубатор			Используется для инкубации жидких среды и масла.
Инкубатор пластин			Используется для инкубации тарелок.
Фарфоровая ступка с пестиком	Томас научный/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	Используется для мацерации фрагментов кораллов.
Рефрижераторная центрифуга			Используется для центрифуг бактериальных культур.
Спектрофотометр			Используется для измерения оптической плотности бактериальных культур.
Набор для очистки геномной ДНК Wizard	Promega	A1120	Используется для экстракции ДНК микробных штаммов.