Отслеживание роста бактерий с одноклеточным разрешением в микрофлюидной системе

Аннотация

Источник: Кабин, М. Т. и др. Одноклеточный микрофлюидный анализ Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)

В видео демонстрируется использование микрофлюидного устройства для наблюдения за ростом бактерий на уровне одной клетки. В ней показано, как неподвижные бактериальные клетки, заключённые в микромасштабных окопах, постоянно питаются и визуализируются под флуоресцентным микроскопом. Система позволяет визуализировать деление клеток и отслеживание родословной в реальном времени в нескольких поколениях.

Протокол

1. Трансляция устройства PDMS

1. В условиях без пыли смешайте полимер с полимером Полидиметилсилоксана (PDMS) и отверждающим агентом в соотношении 10:1 и дегазируйтесь в вакууме не менее 10 минут.
2. Поместите кремниевой мастер (или его эпоксидную или полиуретановую копию) на кусок целой алюминиевой фольги в полистироловой пластине Петри. Вылейте дегазированную смесь PDMS на главный корпус на глубину примерно 5 мм. Дегаз с пластины Петри минимум на 10 минут. Используйте мягкий поток воздуха, чтобы разбить поверхностные пузырьки.
   ЗАМЕТКА: Пластиковая реплика мастера может частично плавать во время дегазации; Если это случится, опустите копию чистым пластиковым аппликатором.
3. Отварить PDMS не менее 1 часа в духовке при 60 °C и остыть до комнатной температуры. Удалите алюминиевую фольгу, содержащую главную и отвергнувшую PDMS, с пластины Петри. Аккуратно снимите алюминиевую фольгу с задней части мастера, затем аккуратно снимите PDMS с главного корпуса.
   ЗАМЕТКА: В качестве альтернативы PDMS можно вылечить за ночь при комнатной температуре. Относительную хрупкость кремниевой пластины можно преодолеть, используя эпоксидный клей для постоянного соединения пластины с алюминиевым диском толщиной 1/16 дюйма того же размера, что и пластина.
4. Поскольку пластина обычно включает несколько микрофлюидных устройств с немного разными размерами, вырежьте одно устройство по размеру с помощью чистого, острого скальпеля.
   ЗАМЕТКА: Для рутинной работы с Bacillus subtilis используйте устройства с ячеточными траншеями шириной 1,0 мкм.

2. Пробивание и сцепление устройств

1. Положите кусок полупрозрачной офисной ленты (см. Таблицу материалов) на узорчатую сторону устройства, чтобы улучшить видимость узорчатых элементов. Входные и выходные отверстия обозначены как круглые участки на противоположных концах видимых жидкостных каналов (рисунок 1). Для улучшения видимости при пробивании отверстий для входных и выходных выводов отметьте входы и выходы точками маркером с тонким наконечником.
   ЗАМЕТКА: Чтобы не было перегружены входные и выходные контакты, все остальные каналы пробиваются, начиная с канала чуть ниже алфавитного обозначения устройства.
2. Перевернуть устройство PDMS так, чтобы узорная сторона была вниз, и проколоть устройство до отмеченных точек с помощью биопсийного пунша диаметром 0,75 мм; Отбросьте удары.
   ЗАМЕТКА: Устройства пробиваются с узорной стороной вниз, потому что отверстие, образуемое биопсийным пуншоном, обычно слегка расширено там, где пуансон входит в полимер. Пробивание устройства в перевернутом положении гарантирует, что отверстие на узорчатой стороне имеет острый край.
3. С помощью стереомикроскопа убедитесь, что пробитые отверстия совпадают с входными и выходными зонами устройства. Используйте пинцет с тонким наконечником, чтобы удалить лишние фрагменты PDMS из пробитых отверстий.
4. Используйте клейкую ленту, чтобы удалить пыль с обеих сторон устройства, и поместите её в чистую полистироловую пластину Петри. Подготовьте крышное стекло размером 22 мм x 40 мм, смачивая 100% изопропиловым спиртом и натирая чистой салфеткой; Сушить с помощью потока воздуха без пыли или азота.
5. Положите перфорированное PDMS-устройство лицом вверх вместе с очищенным стеклом крышки в очиститель кислородной плазмы.
   1. Плазменно обработайте устройство со следующими настройками: вакуум, 70 мТорр; O₂ давление — 200 мТорр; продолжительность — 15 с; Мощность — 30 Вт. Сразу после окончания периода обработки плазмой снимите устройство и закройте стекло из плазмоочистителя.
   2. Переверните PDMS и разместите его в центре стекла так, чтобы узорчатая сторона соприкасалась с стеклом; Убедитесь, что подающие каналы (проходящие между входной и выходной зонами) выровнены с длинной осью крышного стекла. Очень аккуратно прижимайте, чтобы PDMS прилипал к стеклу.
6. Запекайте собранное устройство в духовке не менее 1 часа при 60 °C. После выпечки вручную проверяйте, что PDMS прикреплён к стеклу, мягко надавливая на один угол устройства.
   ЗАМЕТКА: После склеивания устройство следует использовать в течение 24 часов, так как полимер становится всё более гидрофобным со временем после обработки плазмой.

3. Подготовка микрофлюидных сантехнических процедур

1. Отрезать длины полимерной трубки (внутренний диаметр (ID) 0,02 дюйма, внешний диаметр (OD) 0,06 дюйма) до нужной длины для доступа от насоса шприца до переключающего устройства (если он используется) и устройства при установке на микроскоп. Срежьте как можно больше микрофлюидных дорожек.
2. Собрать Y-образные соединения для защитных клапанов (если используются), вырезав и прикрепив 2-сантиметровые отрезки гибкой силиконовой трубки (0,03 дюйма ID, 0,065 дюйма OD) к верхним зауножкам «Y» и 1 см силиконовой трубки к нижней зарубке «Y».
3. Вырезать 10-см (или соответствующие) отрезки полимерной трубки; Соедините их с одного конца с переключателем, вставив в 1-сантиметровые сегменты силиконовой трубки на нижней шипе буквы «Y». Подключите их на другом конце к иглам 21G, которые были извлечены из пластиковых адаптеров для шприцев и согнуты примерно на 90° примерно на 9 мм от конца иглы.
4. Подключите тупые иглы 21G к одному концу сегментов трубки, которые будут идти от шприцев к прибору переключателя, вставив иглы в трубку. Вставьте остальные концы каждого участка трубки в сегменты силиконовой трубки на входных барбусах Y-образных соединений.
   ЗАМЕТКА: Используйте какое-то устройство, чтобы удерживать защитные клапаны и соединители на месте; её легко изготовить из коробки для наконечников микропипетки (рисунок 2D).
5. Отрезать отрезки полимерной трубки для транспортировки отходов от выхода устройства к стеку для отходов. Соедините их с одного конца с изогнутыми иглами 21G, подготовленными, как описано выше. Заклейте другой конец трубок в стек для отходов.
6. Подготовьте соответствующие объемы среды с содержанием 0,1 мг/мл бычьей сыворотки альбумина (BSA) и наполните нужный размер и количество шприцев. Подключите шприцы с нагрузкой BSA к подготовленным иглам 21G, прикреплённым к впускной трубке, и загрузите шприцы в насосы.
   ЗАМЕТКА: Для типичных экспериментов используется 5 каналов устройства, каждый с шприцом объемом 20 мл. Эксперимент с переключением среды потребует 2 банки по 5 шприцев каждый. Здесь насос с первым блоком называется насосом фазы 1, а насос с вторым блоком и средой после переключения — насосом фазы 2.
7. Продувайте воздух из входной трубы, запуская насосы шприцев с высокой скоростью потока (>500 мкл/мин), начиная с вертикальной ориентации насосов и постукивания по шприцам, чтобы поднять пузырьки воздуха наверх. После того как воздух из шприцев будет выведен из шприцев, разместите насос горизонтально и постепенно протягивайте полимерные линии от шприцев вверх через переключатель, чтобы сдвинуть и очистить пузырьки воздуха. Повторите этот процесс для второй партии шприцев (если меняете носитель).
8. После очистки пузырьков воздуха установите насос фазы 2 (то есть носитель, который будет использоваться вторым после переключения) на 1,5 мкл/мин, затем приостановите поток. Поместите маленькие связующие клипсы на сегменты гибкой трубки на ветви Y-узлов, соответствующих второй средней фазе. Продолжайте работать шприцовым насосом фазы 1 с умеренным расходом (например, 10 мкл/мин) не менее 30 минут, чтобы очистить впускную трубку ниже по течению от Y-соединения.

4. Подготовка клеточной культуры

1. Выращивайте прекультуру интереса в нужной среде за ночь, переходя в стационарную фазу. Бактериальный штамм должен содержать мутацию, которая делает клетки неподвижными, чтобы клетки не выплывали из каналов устройства.
   ЗАМЕТКА: В этом протоколе бактериальный штамм — B. subtilis 3610, содержащий замещение HagA233V (эта мутация делает жгутик прямым, а не спиральным, препятствуя подвижности клеток), репортер PrsbV-mNeonGreen для клеточного стресса и конститутивный репортер Phyperspank-mNeptune (красный) для выделения клеток. В примере протокола используется среда Лурия-Бертани (LB) Леннокса. Типичные штаммы для экспериментов с микрофлюидикой содержат один или несколько флуоресцентных транскрипционных репортеров и конститутивно произведённый цитоплазматический флуоресцентный белок для облегчения автоматизированного обнаружения клеток. Дефекты роста не наблюдались при использовании среды, богатой LB Lennox, но рост B. subtilis в минимальной среде может быть подавлен в микрофлюидных условиях, поскольку выделенные сидерофоры смываются потоком среды. В таких условиях роста может быть восстановлен за счёт добавления цитра натрия и хлорида железа в среду, как сообщается для среды S750.
2. Утром в день эксперимента разведите клетки B. subtilis на 1:50 в запутанную колбу объёмом 250 мл с 25 мл ростовой среды. Выращивайте клетки в течение 5–6 часов в встряхивающей культуре при 37 °C до оптической плотности более 1.
   ЗАМЕТКА: Плотная культура клеток предпочтительна, поскольку клетки субтилис в стационарной фазе B. subtilis меньше и реже встречаются в цепочках клеток, что способствует загрузке устройств. Разным видам бактерий могут требоваться другие среды или условия роста для оптимального нагрузки.
3. Используя шприц, оснащённый поровым фильтром размером 5 мкм, фильтруйте примерно 15 мл клеточной культуры в коническую трубку объёмом 15 мл для удаления цепочек клеток B. subtilis (это не нужно для E. coli и может не быть необходимым для других видов).
   ЗАМЕТКА: Следует удалять относительно мало клеток; Фильтрат должен быть мутным.
4. Центрифугуйте фильтрованную культуру на 10 минут при 4000 г при комнатной температуре. Слейте супернатант и снова суспензируйте клеточную гранулу в остаточной супернатантной жидкости, оставшейся в трубке, при необходимости добавляя примерно 500 мкл свежей среды для облегчения пипетирования суспензии клетки.

5. Загрузка устройств

1. Аккуратно поместите пустые тонкие наконечники микропипетки с гелем (см. таблицу материалов) в выходные отверстия микрофлюидического устройства.
2. Используя тонкие наконечники с гелевой загрузкой с микропипеткой P200, пассивируйте устройство, вводя среду с 1 мг/мл BSA во входные отверстия, наблюдая за наконечниками в выходных отверстиях для контроля заполнения микрофлюидных каналов (см. рисунок 2A). Инкубировать устройство при комнатной температуре примерно 5 минут.
   ЗАМЕТКА: BSA обычно используется как блокирующий или пассивный агент, который связывается с гидрофобной поверхностью полимера PDMS, увеличивая его гидрофильность и снижая связывание других белков или клеток (через молекулы поверхности клеток).
3. Используя тонкие гелевые наконечники, загружите каждый канал подвесными элементами (из раздела 4), используя наконечники выходного канала для мониторинга движения ячеек через устройство (рисунок 2B).
   ЗАМЕТКА: Загрузка облегчается установкой микропипетки P200 на максимальный объём 200 мкл, а затем аспирированием подушки воздуха перед аспирацией небольшого объёма (примерно половины объёма тонкой части кончика пипетки) ячеек. Объём ревзвешенных клеток не обязательно должен быть точным, так как объём PDMS-устройства невелик по сравнению с объёмом микропипетки. Мы не знаем верхнего предела плотности ревзвешенных ячеек, если подвеска ячейки может быть пипетирована в устройство. Клеточные комки могут засорить устройство, и их следует избегать с помощью тщательной пипетировки и/или смешивания вихров.
4. Аккуратно удаляйте наконечники геля из отверстий выхода, работая по одному, чтобы предотвратить повреждение устройства.
5. Центрифугуйте устройство в настольной микроцентрифуге в соответствующем роторном адаптере примерно 6000 x g в течение 10 минут (рисунок 2C).
   ЗАМЕТКА: Использовался специально обработанный алюминиевый роторный адаптер, предназначенный для установки в микроцентрифугальный ротор (рисунок 2C); Могут использоваться различные модели центрифуг с соответствующими роторными адаптерами. Важная особенность адаптера заключается в том, что он создаёт боковую силу в направлении замкнутых концов клеточных траншей, тем самым заставляя клетки проникать в боковые каналы.
6. Проверьте успешную загрузку под микроскопом (рисунок 3), но не прикрепляйте устройство к держателю затвора/вставке ступени.
   ЗАМЕТКА: В этом протоколе используется масляный иммерсионный объектив 60X, 1,4 NA Ph3 как для верификации на этом этапе, так и для последующей визуализации.

6. Сборка, уравновесление и монтаж устройства

1. Аккуратно закрепите загруженное устройство на вставку для сцены, приклеив стекло крышки с обеих сторон PDMS к нижней части инсерта (то есть инвертируйте вставку перед прикреплением устройства). Инвертируйте сборку вставки ступени так, чтобы PDMS была направлена вверх, и разместите его на мягкой поверхности, например, на безпыльной салфетке (рисунок 2D).
2. Отрегулировать расход насоса фазы 1 на 35 мкл/мин. Работая по одной полосе за раз, вводите впускную стрелку, а затем выходную стрелку (то есть идите к стеклу для отходов; Рисунок 2E).
3. Протрите лишний материал чистой салфеткой без пыли и визуально осмотрите устройство на наличие протечек. Осмотрите выходную трубку на наличие избыточных клеток (обычно выглядящих мутной полосой) и среднего мениска, который будет медленно двигаться к стакану для отходов.
4. Позвольте устройству работать со скоростью 35 мкл/мин примерно 15–30 минут, пока все соединённые полосы не сливаются в стакан для отходов.
5. Установите насос для шприца фазы 1 на 1,5 мкл/мин и приостановите поток. Поднесите весь насос и аппарат к микроскопу (этот процесс облегчается размещением их на тележке для движения) и перезапустите поток среды фазы 1 со скоростью 1,5 мкл/мин. Аккуратно закрепите вставку для сцены вместе с устройством на инвертированный флуоресцентный микроскоп, при необходимости используя ленту для прокладки входной и выходной трубок.
6. Определите нужные позиции на устройстве для съёмки и начните съёмку по мере необходимости. Обратите внимание, что клеткам обычно требуется несколько часов (примерно 10 поколений), чтобы достичь устойчивого экспоненциального роста, и начало получения изображения может быть отложено по мере необходимости, чтобы после периода уравновесия началась визуализация.
   ЗАМЕТКА: Устойчивый рост клеток, удерживаемых в экспоненциальной фазе, следует проверять при последующем анализе изображений, отслеживая время деления клеток и обеспечивая их достигнутое постоянное минимальное значение.

Результаты

Рисунок 1: Схема микрофлюидического устройства. Схема устройства показана примерно в масштабе. Алфавитное обозначение маркируется вместе с зонами входа и выхода, которые пробиваются для соединения тупых иголок. Обычно используется половина ...

Материалы