1. Трансляция устройства PDMS
- В условиях без пыли смешайте полимер с полимером Полидиметилсилоксана (PDMS) и отверждающим агентом в соотношении 10:1 и дегазируйтесь в вакууме не менее 10 минут.
- Поместите кремниевой мастер (или его эпоксидную или полиуретановую копию) на кусок целой алюминиевой фольги в полистироловой пластине Петри. Вылейте дегазированную смесь PDMS на главный корпус на глубину примерно 5 мм. Дегаз с пластины Петри минимум на 10 минут. Используйте мягкий поток воздуха, чтобы разбить поверхностные пузырьки.
ЗАМЕТКА: Пластиковая реплика мастера может частично плавать во время дегазации; Если это случится, опустите копию чистым пластиковым аппликатором. - Отварить PDMS не менее 1 часа в духовке при 60 °C и остыть до комнатной температуры. Удалите алюминиевую фольгу, содержащую главную и отвергнувшую PDMS, с пластины Петри. Аккуратно снимите алюминиевую фольгу с задней части мастера, затем аккуратно снимите PDMS с главного корпуса.
ЗАМЕТКА: В качестве альтернативы PDMS можно вылечить за ночь при комнатной температуре. Относительную хрупкость кремниевой пластины можно преодолеть, используя эпоксидный клей для постоянного соединения пластины с алюминиевым диском толщиной 1/16 дюйма того же размера, что и пластина. - Поскольку пластина обычно включает несколько микрофлюидных устройств с немного разными размерами, вырежьте одно устройство по размеру с помощью чистого, острого скальпеля.
ЗАМЕТКА: Для рутинной работы с Bacillus subtilis используйте устройства с ячеточными траншеями шириной 1,0 мкм.
2. Пробивание и сцепление устройств
- Положите кусок полупрозрачной офисной ленты (см. Таблицу материалов) на узорчатую сторону устройства, чтобы улучшить видимость узорчатых элементов. Входные и выходные отверстия обозначены как круглые участки на противоположных концах видимых жидкостных каналов (рисунок 1). Для улучшения видимости при пробивании отверстий для входных и выходных выводов отметьте входы и выходы точками маркером с тонким наконечником.
ЗАМЕТКА: Чтобы не было перегружены входные и выходные контакты, все остальные каналы пробиваются, начиная с канала чуть ниже алфавитного обозначения устройства. - Перевернуть устройство PDMS так, чтобы узорная сторона была вниз, и проколоть устройство до отмеченных точек с помощью биопсийного пунша диаметром 0,75 мм; Отбросьте удары.
ЗАМЕТКА: Устройства пробиваются с узорной стороной вниз, потому что отверстие, образуемое биопсийным пуншоном, обычно слегка расширено там, где пуансон входит в полимер. Пробивание устройства в перевернутом положении гарантирует, что отверстие на узорчатой стороне имеет острый край. - С помощью стереомикроскопа убедитесь, что пробитые отверстия совпадают с входными и выходными зонами устройства. Используйте пинцет с тонким наконечником, чтобы удалить лишние фрагменты PDMS из пробитых отверстий.
- Используйте клейкую ленту, чтобы удалить пыль с обеих сторон устройства, и поместите её в чистую полистироловую пластину Петри. Подготовьте крышное стекло размером 22 мм x 40 мм, смачивая 100% изопропиловым спиртом и натирая чистой салфеткой; Сушить с помощью потока воздуха без пыли или азота.
- Положите перфорированное PDMS-устройство лицом вверх вместе с очищенным стеклом крышки в очиститель кислородной плазмы.
- Плазменно обработайте устройство со следующими настройками: вакуум, 70 мТорр; O₂ давление — 200 мТорр; продолжительность — 15 с; Мощность — 30 Вт. Сразу после окончания периода обработки плазмой снимите устройство и закройте стекло из плазмоочистителя.
- Переверните PDMS и разместите его в центре стекла так, чтобы узорчатая сторона соприкасалась с стеклом; Убедитесь, что подающие каналы (проходящие между входной и выходной зонами) выровнены с длинной осью крышного стекла. Очень аккуратно прижимайте, чтобы PDMS прилипал к стеклу.
- Запекайте собранное устройство в духовке не менее 1 часа при 60 °C. После выпечки вручную проверяйте, что PDMS прикреплён к стеклу, мягко надавливая на один угол устройства.
ЗАМЕТКА: После склеивания устройство следует использовать в течение 24 часов, так как полимер становится всё более гидрофобным со временем после обработки плазмой.
3. Подготовка микрофлюидных сантехнических процедур
- Отрезать длины полимерной трубки (внутренний диаметр (ID) 0,02 дюйма, внешний диаметр (OD) 0,06 дюйма) до нужной длины для доступа от насоса шприца до переключающего устройства (если он используется) и устройства при установке на микроскоп. Срежьте как можно больше микрофлюидных дорожек.
- Собрать Y-образные соединения для защитных клапанов (если используются), вырезав и прикрепив 2-сантиметровые отрезки гибкой силиконовой трубки (0,03 дюйма ID, 0,065 дюйма OD) к верхним зауножкам «Y» и 1 см силиконовой трубки к нижней зарубке «Y».
- Вырезать 10-см (или соответствующие) отрезки полимерной трубки; Соедините их с одного конца с переключателем, вставив в 1-сантиметровые сегменты силиконовой трубки на нижней шипе буквы «Y». Подключите их на другом конце к иглам 21G, которые были извлечены из пластиковых адаптеров для шприцев и согнуты примерно на 90° примерно на 9 мм от конца иглы.
- Подключите тупые иглы 21G к одному концу сегментов трубки, которые будут идти от шприцев к прибору переключателя, вставив иглы в трубку. Вставьте остальные концы каждого участка трубки в сегменты силиконовой трубки на входных барбусах Y-образных соединений.
ЗАМЕТКА: Используйте какое-то устройство, чтобы удерживать защитные клапаны и соединители на месте; её легко изготовить из коробки для наконечников микропипетки (рисунок 2D). - Отрезать отрезки полимерной трубки для транспортировки отходов от выхода устройства к стеку для отходов. Соедините их с одного конца с изогнутыми иглами 21G, подготовленными, как описано выше. Заклейте другой конец трубок в стек для отходов.
- Подготовьте соответствующие объемы среды с содержанием 0,1 мг/мл бычьей сыворотки альбумина (BSA) и наполните нужный размер и количество шприцев. Подключите шприцы с нагрузкой BSA к подготовленным иглам 21G, прикреплённым к впускной трубке, и загрузите шприцы в насосы.
ЗАМЕТКА: Для типичных экспериментов используется 5 каналов устройства, каждый с шприцом объемом 20 мл. Эксперимент с переключением среды потребует 2 банки по 5 шприцев каждый. Здесь насос с первым блоком называется насосом фазы 1, а насос с вторым блоком и средой после переключения — насосом фазы 2. - Продувайте воздух из входной трубы, запуская насосы шприцев с высокой скоростью потока (>500 мкл/мин), начиная с вертикальной ориентации насосов и постукивания по шприцам, чтобы поднять пузырьки воздуха наверх. После того как воздух из шприцев будет выведен из шприцев, разместите насос горизонтально и постепенно протягивайте полимерные линии от шприцев вверх через переключатель, чтобы сдвинуть и очистить пузырьки воздуха. Повторите этот процесс для второй партии шприцев (если меняете носитель).
- После очистки пузырьков воздуха установите насос фазы 2 (то есть носитель, который будет использоваться вторым после переключения) на 1,5 мкл/мин, затем приостановите поток. Поместите маленькие связующие клипсы на сегменты гибкой трубки на ветви Y-узлов, соответствующих второй средней фазе. Продолжайте работать шприцовым насосом фазы 1 с умеренным расходом (например, 10 мкл/мин) не менее 30 минут, чтобы очистить впускную трубку ниже по течению от Y-соединения.
4. Подготовка клеточной культуры
- Выращивайте прекультуру интереса в нужной среде за ночь, переходя в стационарную фазу. Бактериальный штамм должен содержать мутацию, которая делает клетки неподвижными, чтобы клетки не выплывали из каналов устройства.
ЗАМЕТКА: В этом протоколе бактериальный штамм — B. subtilis 3610, содержащий замещение HagA233V (эта мутация делает жгутик прямым, а не спиральным, препятствуя подвижности клеток), репортер PrsbV-mNeonGreen для клеточного стресса и конститутивный репортер Phyperspank-mNeptune (красный) для выделения клеток. В примере протокола используется среда Лурия-Бертани (LB) Леннокса. Типичные штаммы для экспериментов с микрофлюидикой содержат один или несколько флуоресцентных транскрипционных репортеров и конститутивно произведённый цитоплазматический флуоресцентный белок для облегчения автоматизированного обнаружения клеток. Дефекты роста не наблюдались при использовании среды, богатой LB Lennox, но рост B. subtilis в минимальной среде может быть подавлен в микрофлюидных условиях, поскольку выделенные сидерофоры смываются потоком среды. В таких условиях роста может быть восстановлен за счёт добавления цитра натрия и хлорида железа в среду, как сообщается для среды S750. - Утром в день эксперимента разведите клетки B. subtilis на 1:50 в запутанную колбу объёмом 250 мл с 25 мл ростовой среды. Выращивайте клетки в течение 5–6 часов в встряхивающей культуре при 37 °C до оптической плотности более 1.
ЗАМЕТКА: Плотная культура клеток предпочтительна, поскольку клетки субтилис в стационарной фазе B. subtilis меньше и реже встречаются в цепочках клеток, что способствует загрузке устройств. Разным видам бактерий могут требоваться другие среды или условия роста для оптимального нагрузки. - Используя шприц, оснащённый поровым фильтром размером 5 мкм, фильтруйте примерно 15 мл клеточной культуры в коническую трубку объёмом 15 мл для удаления цепочек клеток B. subtilis (это не нужно для E. coli и может не быть необходимым для других видов).
ЗАМЕТКА: Следует удалять относительно мало клеток; Фильтрат должен быть мутным. - Центрифугуйте фильтрованную культуру на 10 минут при 4000 г при комнатной температуре. Слейте супернатант и снова суспензируйте клеточную гранулу в остаточной супернатантной жидкости, оставшейся в трубке, при необходимости добавляя примерно 500 мкл свежей среды для облегчения пипетирования суспензии клетки.
5. Загрузка устройств
- Аккуратно поместите пустые тонкие наконечники микропипетки с гелем (см. таблицу материалов) в выходные отверстия микрофлюидического устройства.
- Используя тонкие наконечники с гелевой загрузкой с микропипеткой P200, пассивируйте устройство, вводя среду с 1 мг/мл BSA во входные отверстия, наблюдая за наконечниками в выходных отверстиях для контроля заполнения микрофлюидных каналов (см. рисунок 2A). Инкубировать устройство при комнатной температуре примерно 5 минут.
ЗАМЕТКА: BSA обычно используется как блокирующий или пассивный агент, который связывается с гидрофобной поверхностью полимера PDMS, увеличивая его гидрофильность и снижая связывание других белков или клеток (через молекулы поверхности клеток). - Используя тонкие гелевые наконечники, загружите каждый канал подвесными элементами (из раздела 4), используя наконечники выходного канала для мониторинга движения ячеек через устройство (рисунок 2B).
ЗАМЕТКА: Загрузка облегчается установкой микропипетки P200 на максимальный объём 200 мкл, а затем аспирированием подушки воздуха перед аспирацией небольшого объёма (примерно половины объёма тонкой части кончика пипетки) ячеек. Объём ревзвешенных клеток не обязательно должен быть точным, так как объём PDMS-устройства невелик по сравнению с объёмом микропипетки. Мы не знаем верхнего предела плотности ревзвешенных ячеек, если подвеска ячейки может быть пипетирована в устройство. Клеточные комки могут засорить устройство, и их следует избегать с помощью тщательной пипетировки и/или смешивания вихров. - Аккуратно удаляйте наконечники геля из отверстий выхода, работая по одному, чтобы предотвратить повреждение устройства.
- Центрифугуйте устройство в настольной микроцентрифуге в соответствующем роторном адаптере примерно 6000 x g в течение 10 минут (рисунок 2C).
ЗАМЕТКА: Использовался специально обработанный алюминиевый роторный адаптер, предназначенный для установки в микроцентрифугальный ротор (рисунок 2C); Могут использоваться различные модели центрифуг с соответствующими роторными адаптерами. Важная особенность адаптера заключается в том, что он создаёт боковую силу в направлении замкнутых концов клеточных траншей, тем самым заставляя клетки проникать в боковые каналы. - Проверьте успешную загрузку под микроскопом (рисунок 3), но не прикрепляйте устройство к держателю затвора/вставке ступени.
ЗАМЕТКА: В этом протоколе используется масляный иммерсионный объектив 60X, 1,4 NA Ph3 как для верификации на этом этапе, так и для последующей визуализации.
6. Сборка, уравновесление и монтаж устройства
- Аккуратно закрепите загруженное устройство на вставку для сцены, приклеив стекло крышки с обеих сторон PDMS к нижней части инсерта (то есть инвертируйте вставку перед прикреплением устройства). Инвертируйте сборку вставки ступени так, чтобы PDMS была направлена вверх, и разместите его на мягкой поверхности, например, на безпыльной салфетке (рисунок 2D).
- Отрегулировать расход насоса фазы 1 на 35 мкл/мин. Работая по одной полосе за раз, вводите впускную стрелку, а затем выходную стрелку (то есть идите к стеклу для отходов; Рисунок 2E).
- Протрите лишний материал чистой салфеткой без пыли и визуально осмотрите устройство на наличие протечек. Осмотрите выходную трубку на наличие избыточных клеток (обычно выглядящих мутной полосой) и среднего мениска, который будет медленно двигаться к стакану для отходов.
- Позвольте устройству работать со скоростью 35 мкл/мин примерно 15–30 минут, пока все соединённые полосы не сливаются в стакан для отходов.
- Установите насос для шприца фазы 1 на 1,5 мкл/мин и приостановите поток. Поднесите весь насос и аппарат к микроскопу (этот процесс облегчается размещением их на тележке для движения) и перезапустите поток среды фазы 1 со скоростью 1,5 мкл/мин. Аккуратно закрепите вставку для сцены вместе с устройством на инвертированный флуоресцентный микроскоп, при необходимости используя ленту для прокладки входной и выходной трубок.
- Определите нужные позиции на устройстве для съёмки и начните съёмку по мере необходимости. Обратите внимание, что клеткам обычно требуется несколько часов (примерно 10 поколений), чтобы достичь устойчивого экспоненциального роста, и начало получения изображения может быть отложено по мере необходимости, чтобы после периода уравновесия началась визуализация.
ЗАМЕТКА: Устойчивый рост клеток, удерживаемых в экспоненциальной фазе, следует проверять при последующем анализе изображений, отслеживая время деления клеток и обеспечивая их достигнутое постоянное минимальное значение.
