$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Условия бактериального посева.
- Работая под ламинарным вытяжкой, используйте 100 мкл глицерилового запаса зелёного флуоресцентного белка ( GFP) Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 мл-1, хранящегося при -80 °C) для инокуляции 5 мл среды Luria-Bertani (LB). Инкубировать при 30 °C при встряхивании при 250 об/мин ночью.
- На следующий день повторно суспендировать 100 мкл ночной культуры в среде 5 мл LB и инкубировать в тех же условиях в течение 5 часов (экспоненциальная фаза). Возьмите пробу из аликвота объёмом 1 мл в трубку на 2 мл, дайте остыть до комнатной температуры (~15 мин) и центрифугу (2300 x г на 5 минут).
- Удалите супернатант и добавьте буфер подвижности 1 мл в гранулу. Вихрь кратко для гомогенизации образца. Разбавлять для достижения нужной концентрации клеток, например, 5 x 105 мл-1.
- Для экспериментов с участием природных сообществ, таких как те, что происходят из ручьёв, подготовьте неселективную почву для культивации. Например, используйте стерильно фильтрованную и автоклавированную воду, либо искусственную водную среду с добавлением сложного углеродного источника (LB-среды).
2. Подготовка микрофлюидного устройства в полидиметилсилоксане (PDMS)
- Спроектировать желаемую пористую геометрию с помощью программного обеспечения для компьютерного черчения (CAD), которое состоит из матрицы окружностей (то есть непроницаемого препятствия для течения), описываемых размером радиуса и координатами центра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример пористой геометрии с рандомизированными размерами зерен и пор приведён на рисунке 1A. Канал наблюдения без препятствий вблизи выхода облегчает получение прорывных кривых (BTC). - Исходя из выбранной геометрии, подготовьте форму с использованием стандартной фотолитографии SU-8.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы формы можно заказать и в специализированном микропроизводственном центре. Чтобы получить гетерогенный поток жидкости в горизонтальной плоскости, важно спроектировать толщину камеры микрофлюидики на том же порядке, что и средний размер горловины. Однако убедитесь, что размеры микрофлюидного устройства подходят для наблюдения под микроскопом (например, работы с микроскопическими стеклами). - Приготовьте 50 г PDMS, добавив 10% перекрестного сшивателя (диметил, метилгидроген силоксана сополимера) к 90% эластомера по весу, используя шприц без иглы. Работайте в чистых условиях и максимально избегайте пыли. Смешайте оба реагента в чистом одноразовом контейнере и примените вакуум (100 мбар) в течение 30 минут, чтобы удалить растворённый воздух и пузырьки из вязкой ДДМС.
- Поместите форму в чашку Петри (диаметром 100 мм, высотой 15 мм). Залейте PDMS на форму до нужной высоты (например, 2-5 мм). Накройте чашку Петри и держите при 60 °C 4 часа (ночью для более толстых слоёв), чтобы застыть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей визуализации свет должен проходить через PDMS; поэтому желательно использовать тонкий слой от 2 мм до 5 мм. Более толстые слои (>5 мм) снижают прозрачность устройства, а более тонкие слои подвергаются деформациям при нанесении. - Вынимите форму из духовки и дайте микрофлюидному устройству остыть до комнатной температуры. После охлаждения аккуратно удалите нужную часть PDMS скальпелем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сильное давление на форму приводит к её трещинам. Не трогайте PDMS голыми руками, так как отпечатки пальцев повлияют на оптическую прозрачность. - Временно запечатайте нижнюю часть PDMS-канала (где выгравирована нужная геометрия) скотчем. С помощью биопсийного перфоратора диаметром 0,5 мм прорвите микрофлюидный канал, чтобы создать вход и выход для трубки с внутренним диаметром 0,5 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкость PDMS обеспечит плотность после установки трубки. Входные и выходные каналы нельзя сделать после того, как PDMS был герметичен на стекле. - Герметизировать микрофлюидный канал с помощью кислородно-плазменного соединения с помощью высокочастотного генератора (плазменного связывателя, таблица материалов). Для этого очистите силикатное стекло (25 мм x 75 мм) этанолом и дайте высохнуть. Снимите ленту с PDMS-канала и разместите канал так, чтобы пористая сторона была направлена вверх. Обработайте стекло из силикатного стекла и поверхности PDMS плазмой около 45 секунд при комнатной температуре.
- Поставьте PDMS-канал на силикатный стеклянный стекло и нагрейте его при 100 °C в течение 30 минут на горячей плите.
- Снимите микрофлюидное устройство с нагревательной плиты и охладите до комнатной температуры. Подключите вход PDMS-канала трубкой. Подайте вакуум на 30 минут, чтобы удалить воздух из PDMS, который почти непроницаем для жидкостей, но проницаем для газа.
- Подготовьте 100 мл буфера подвижности (10 мМ калийфосфата, 0,1 мМ этилендиаминетрауксусной кислоты (ЭДТА), дополненного 1% w/v глюкозы, pH 7,0) и введите 1 мл в микрофлюидное устройство с помощью шприцового насоса с напряжением 10 мкл мин-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку PDMS недосыщен газом (из-за предыдущего этапа вакуума), пузырьки исчезают в течение ~30 минут.
3. Анализ переноса бактерий с помощью микрофлюидных устройств PDMS
- Разместите микрофлюидное устройство PDMS, ранее насыщенное буфером подвижности, на стадии микроскопа. Используйте ленту для закрепления трубки, чтобы минимизировать нарушения потока во время движения сцены.
- Переместите каскаду микроскопа к наблюдательному каналу ближе к выходу. Используя микроскопию с ярким полем или фазовый контраст, сосредоточьтесь на центре наблюдательного канала и скорректируйте увеличение для визуализации отдельных бактериальных клеток.
- Переключите настройки светового пути на флуоресцентную микроскопию и отрегулируйте время экспозиции камеры так, чтобы отдельные бактериальные клетки (например, 100 мс) или так, чтобы флуоресцентные сигналы клеток были как минимум в 3 раза сильнее фоновых шумов.
- Затем вставьте впускную трубку в трубку объёмом 2 мл, содержащую бактериальную суспензию. Развернуть направление насоса и начать откачивать подвеску с расходом 1 мкл мин-1.
- Сканируйте сечение всего канала наблюдения, записывая составное изображение каждые 2 минуты на протяжении всего эксперимента.
