Трансфекция индуцируемой системы экспрессии генов в клетки, экспрессирующие бактериальный эффекторный белок

Аннотация

Источник: Berens, C. и др. Применение индуцируемой системы экспрессии для изучения интерференции бактериальных факторов вирулентности внутриклеточной сигнализации. J. Vis. Exp . (2015)

В этом видео демонстрируется использование индуцируемой экспрессионной системы для определения места, где бактериальный эффекторный белок CaeB нарушает апоптотический каскад хозяина. В нём описываются шаги трансфекции клеток, экспрессирующих CaeB, с помощью тетрациклин-реагирующей системы, чтобы индуцировать проапоптотическую экспрессию генов с целью выявления точки нарушения внутри каскада.

Протокол

1. Трансфекция стабильной клеточной линии с помощью индуцируемой экспрессионной векторной системы

1. Семена в человеческой эмбриональной почке (HEK)293 клетки, стабильно экспрессирующие зелёный флуоресцентный белок (GFP) или GFP-CaeB в пластине из 12 лунок при плотности 1 x 10⁵ клеток на колодцу.
2. Через 19 часов после посева ко-трансфектировать клетки с регуляторной плазмидой и плазмидой ответа, либо кодируя Bax, либо активированную каспазу 3.
   1. Ко-трансфектировать стабильные клетки HEK293 с 100 нг плазмиды регулятора pWHE125-P (рисунок 1) и 100 нг плазмид ответа pWHE655-hBax или pWHE655-revCasp3 (рисунок 2) и 0,4 мкл полиэтиленимина.
   2. Приготовьте дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и полиэтилениминовый реагент для трансфекции в 75 мкл среды Opti-MEM и инкубировать ровно 5 минут при комнатной температуре (RT). Для формирования комплекса инкубировать обе смеси вместе в течение 15 минут при RT.
3. Добавляйте раствор полиэтиленимина/ДНК по капле в клетки и инкубируют при 37 °C при 5%_CO2.

2. Индукция апоптоза

1. Через 5 часов после трансфекции индуцируют экспрессию проапоптотических белков путем добавления 1 мкг/мл доксициклина в культурную среду. Инкубировать клетки в течение 18 часов при 37 °C при 5%_CO2.

Результаты

Рисунок 1. Схематический обзор регуляторной плазмиды pWHE125. Элементы, необходимые для размножения в бактериях, включая источник репликации (ori pBR) и кассету резистентности к антибиотикам против ампициллина (Amp^R), а такж...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	Жизненные технологии	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Пен/стрептококк	Жизненные технологии	15140-122
OptiMEM	Жизненные технологии	51985
X-tremeGENE 9	Рош	6365752001
Полиэтиленимин	Полисциены	23966
Доксициклин	Сигма Олдрич	D9891