Непрерывный мониторинг биологического шума у бактерий с помощью таймлапс-микроскопии

Аннотация

Источник: Chaimovitz, E. A. и др. Непрерывное измерение биологического шума у Escherichia coli с помощью таймлапс-микроскопии. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует визуализацию биологического шума в E. coli в реальном времени, отслеживая флуктуации флуоресценции GFP во время роста и деления бактерий с помощью таймлапс-микроскопии.

Протокол

1. Подготовка образца к микроскопической визуализации
   1. Выньте колбу из водяной бани. Протрите внешнюю часть колбы и дайте ей остыть до комнатной температуры (25 °C).
      ЗАМЕТКА: Уберите флягу примерно за 3 минуты до окончания таймера.
   2. Постоянно наливайте 3 мл геля по периметру пластины круговым движением. Оставьте затвердеть на несколько минут.
   3. Запечатайте пластины скотчем и проколите несколько отверстий иглой 25 G. Переверните все тарелки, чтобы не капать конденсат воды на гель.
   4. Инкубировать все блюда при 4 °C в течение 30 минут, чтобы обеспечить полное затвердевание и предотвратить митоз клеток.
      ЗАМЕТКА: Оставляйте образцы при 4 °C для последовательных измерений, не более одного дня.
   5. Начинайте использовать микроскоп согласно инструкции производителя.
   6. Определите начальный фокус с использованием линзы с наименьшим усилением и включите систему автоматической фокусировки (AFS).
   7. При необходимости используйте масло, затопите линзу маслом и аккуратно распределите её, двигая пластину с помощью контроллера платформы (не вручную), и AFS можно снова включить.
   8. Используйте относительное сечение в направлении Z, следуя стандартному предложению для Z-ступенчатых сечений.
      ЗАМЕТКА: Делайте яркие изображения каждые 5 минут и флуоресцентные изображения каждые 20 минут. Иногда фокус нужно корректировать в первые 30 минут. Предварительное нагрев коробки микроскопа и масла при хранении образца в холодильнике помогает уменьшить первоначальную потерю фокуса.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
35-мм стеклянная тарелка	Маттек	P35G-0.170-14-C	Толщина, соответствующая линзе микроскопа.
Агароза	Лонза	5004	Подготовка LB
Затмение Ти	Nikon		Инвертированный микроскоп
Immersol 518F	Zeiss	4449600000000	Погружное масло
Парафильмная лента	Бемис	PM-996	В тексте упоминается как лента