Обнаружение экспрессии целевых ферментов в генетически модифицированных бактериальных клетках

Аннотация

Источник: Kim, H. и др., Мультиферментный скрининг с использованием высокопроизводительной системы генетического ферментного скрининга. J. Vis. Exp .(2016)

В этом видео демонстрируется метод генетического скрининга для обнаружения экспрессии ферментов с использованием метагеномных фосмидных библиотек и хромогенных субстратов. Потоковая цитометрия выявляет и изолирует отдельные клетки, образующие цветные продукты, что позволяет проводить высокопроизводительный отбор активных ферментных клеток.

Протокол

1. Подготовка Метагеномной библиотеки с помощью системы генетического ферментного скрининга для обнаружения p-нитрофенола (pNP) (pNP-GESS)
   1. Постройте метагеномную библиотеку в Escherichia coli с фосмид-вектором, используя набор для производства библиотеки фосмидов.
   2. Аликвот 100 мкл библиотеки для хранения при −70 °C, что является источником метагеномных библиотечных ячеек.
      ЗАМЕТКА: Оптическая плотность образца, измеренного на длине волны 600 нм (_{OD 600}) из этого библиотечного фонда, составляет примерно 100.
   3. Разморозить 100 мкл стандартной метагеномной библиотеки на льду и инокулять в колбу объемом 500 мл, содержащую 50 мл Лурия-Бертани (LB) и 12,5 мкг/мл хлорамфеникола, после чего инкубировать при 37 °C в течение 2 часов.
   4. Соберите клетки в конической трубке объемом 50 мл путём центрифугации при 1000 x g в течение 20 минут при 4 °C.
   5. Быстро суспензируйте гранулы в 50 мл ледяной дистиллированной воде (DW) и снова центрифугуйте при температуре 1000 x g на 20 минут при 4 °C.
   6. Суспензируйте гранулу в 50 мкл ледяной температуры DW с 10% (v/v) глицерина. Используйте 50 мкл этой ячейки аликвота для электропорации.
   7. Смесь электрокомпетентных элементов 50 мкл и pGESS(E135K) ДНК (100 нг) поместите в ледяную электропорационную кювету и электропоратируйте (1,8 кВ/см, 25 мкФ) смесь.
   8. Быстро добавьте 1 мл супер-оптимального бульона с катболитной репрессионной средой (SOC) и аккуратно зафиксируйте клетки.
   9. Переместите клетки в трубку с круглым дном объёмом 14 мл с помощью пипетки и инкубируйте при 37 °C в течение 1 часа.
   10. Распределить 500 мкл восстановленных клеток на пластину LB размером 20 x 20 см, содержащую 12,5 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл ампициллина. Инкубировать тарелку при 30 °C в течение 12 часов.
   11. Соскребите колонии с помощью скребка и соберите клетки в коническую трубку объёмом 50 мл с использованием среды хранения клеток.
   12. Центрифугировать при 1000 г в течение 20 минут при 4 °C. Повторно суспензировать гранулу в 10 мл ледяной ячейки для OD₆₀₀ от 100.
   13. Аликвот 20 мкл элементов для хранения при −70 °C.
        
2. Удаление ложноположительных результатов из метагеномной библиотеки
   1. Разморозить стандартные метагеномные библиотеки клетки (начиная с шага 1.13), содержащие метагеномную ДНК, фосмид и pGESS(E135K), на льду.
   2. Инокуляция 10 мкл клеток в 2 мл LB с 50 мкг/мл ампициллина и 12,5 мкг/мл хлорамфеникола в 14-мл круглодонной трубке. Инкубировать при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 4 часов.
   3. Тем временем включите машину для сортировки клеток с флуоресценцией (FACS) и откройте стандартное программное обеспечение FACS. Используйте следующие параметры: диаметр наконечника сопла — 70 мкм; чувствительность прямой области рассеяния (FSC-A), 300 V-логарифмическое усиление; чувствительность боковой области рассеяния (SSC-A), 350 В логарифмическое усиление; чувствительность к области изотиоцианата флуоресцеина (FITC-A), амплификации 450 V-логарифмической амплификации; пороговый параметр, значение FSC-A 5.
      ЗАМЕТКА: Типичные настройки приведены для устройства FACS, указанных в Таблице материалов. Настройте настройки для других устройств FACS.
   4. Разбавить клетки метагеномной библиотеки с шага 2.2, добавив 5 мкл образца в 5-мл пробирку с круглым дном с 1 мл физиологического раствора (PBS).
   5. Размещённый образец библиотеки поместите на порт загрузки инструмента FACS и нажмите кнопку «Загрузить» на панели получения программного обеспечения FACS.
   6. Отрегулируйте частоту событий до 1 000 - 1 500 событий в секунду, нажав и управляя кнопками Flow Rate на панели управления.
   7. Создайте график рассеяния с масштабированием логарифма FSC-A и SSC-A на глобальном рабочем листе, нажав кнопку Dot Plot на панели инструментов. Настройте элемент рассеяния R1, чтобы охватить синглетные события (популяция бактерий) с помощью кнопки Polygon Gate на панели инструментов.
   8. Нанесите гистограмму с количеством ячеек и логарифмированным FITC-A на рабочем листе, нажав кнопку Гистограмма. Затем отрегулируйте напряжение FITC через вкладку «Настройки цитометра» в окне контроля инспектора так, чтобы пик колоколообразного распределения был менее 10² FITC-A.
   9. Создайте FSC-A с логарифмированным масштабированием по сравнению с логарифм FITC-A, нажав кнопку Dot Plot на глобальном рабочем листе. Установите сортировочный элемент R2 на графике с помощью кнопки Polygon Gate на панели инструментов так, чтобы элементы находились в пределах +5% и -5 % клеток от центра распределения (всего 10% ячеек вокруг вершины колоколообразной кривой).
   10. Разместите сборную трубку с 1,2 мл LB с 50 мкг/мл ампициллина и 12,5 мкг/мл хлорамфеникола на выходе прибора FACS и выделите 10^{из 6} элементов, удовлетворяющих как элементы R1, так и R2.
   11. Снимите сборную трубку, крышку и аккуратно создайте вихрь.
        
3. Скрининг метагеномных ферментов
   1. Инкубировать отсортированные клетки (начиная с шага 2.11) при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин, пока_{OD 600} не достигнет 0.5.
   2. Добавьте индукционный раствор с 1 мкл для усиления внутриклеточного количества копий фосмид. Инкубировать клетки ещё 3 часа при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин.
   3. Для подготовки клеток к сортировке добавьте 0,5 мл культивируемых клеток и соответствующий субстрат (p-нитрофенилацетат, p-нитрофенил-β-D-целлобиозид или фенилфосфат) в круглодонную трубку объемом 14 мл при конечной концентрации 100 мкм.
      1. Для контрольного образца добавьте 0,5 мл культивированных клеток с шага 3.2 в 14-мл пробирку с круглым дном. Добавьте тот же объём PBS, что и объём субстрата, в шаге 3.3.
   4. Инкубировать оба образца при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 3 часов.
   5. Тем временем подготовьте машину FACS с теми же конфигурациями, что и Step 2.3.
   6. Добавьте 5 мкл клеток (для сортировки) и контрольных клеток в две трубки с круглым дном по 5 мл с 1 мл PBS соответственно.
   7. Поставьте трубку с управляющими элементами на порт загрузки FACS и нажмите кнопку Load на панели приобретения программного обеспечения FACS. Отрегулируйте скорость событий до 1 000 - 3 000 событий в секунду, управляя кнопками Flow Rate на панели управления.
   8. Создайте логарифмированный график рассеяния FSC-A против SSC-A с логарифмическим масштабированием, нажав кнопку Dot Plot на глобальном листе программы, и настройте элемент рассеяния R1, чтобы охватить синглетные события (популяция бактерий) с помощью кнопки Polygon Gate на панели инструментов.
   9. Создайте логарифмированный график рассеяния FSC-A и логарифмированного FITC-A, нажав кнопку Dot Plot на рабочем листе, и установите сортировочный элемент R2 на графике с помощью кнопки Polygon Gate на панели инструментов, чтобы в элементе R2 было обнаружено менее 0,1 % отрицательных ячеек.
   10. Замените контрольную пробирку на сортировочную пробирку и регулируйте частоту событий до 1000–3000 событий/сек, управляя кнопками Flow Rate на панели управления.
   11. Поставьте сборную трубку с 0,5 мл LB на выходе прибора FACS и выделите 10^{из 4} ячеек, удовлетворяющих как элементы R1, так и R2.
       ЗАМЕТКА: Критерий сортировки может варьироваться от верхних 0,1% до 5% от FITC-A в воротах R2. В этом протоколе верхние 1% клеток были собраны как положительные.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CopyControl	Эпицентр	CCFOS110	Производственный комплект библиотеки Fosmid
Индукционное решение CopyControl	Эпицентр	CCIS125	Раствор индукционного копирования фосмид
EPI300	Эпицентр	EC300110	Электрокомпетентная ячейка
pCC1FOS	Эпицентр	CCFOS110	Фосмид-вектор
Генный пульсер Mxcell	Био-Рад		Система электропорационной кюветы и электропоратной системы
FACSAria III	Бектон Дикинсон		Потоковая цитометрия (машина FACS)
AZ100M	Nikon		Микроскоп
Ultraslim	Маэстроген		Светодиодный подсветитель
коническая трубка объемом 50 мл	BD Falcon
Трубка с круглым дном объемом 14 мл	BD Falcon
Трубка с круглым дном объемом 5 мл	BD Falcon
p-нитрофенилфосфат	Сигма-Олдрич	N7653	Субстрат
p-нитрофенил β-D-целлобиозид	Сигма-Олдрич	N5759	Субстрат
p-нитрофенилбутилат	Сигма-Олдрич	N9876	Субстрат
Лурия-Бертани (LB)	BD Difco	244620	Триптон 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, хлорид натрия 10 г/л
Супер-оптимальный бульон (SOB)	BD Difco	244310	Триптон 20 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, хлорид натрия 0,5 г/л, сульфат магния 2,4 г/л, хлорид калия 186 мг/л
Супер-оптимальный бульон с катаболитной репрессией (SOC)		SOB, 0,4 % глюкозы
2x экстракт дрожжей триптон (2xYT)	BD Difco	244020	Панкреатический дигест казеина 16 г/л, экстракт дрожжей 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л
Клеточные носители хранения			2x YT бульон, 15% глицерила, 2% глюкозы
pGESS(E135K)			ДНК-вектор, содержащий гены dmpR, egfp с соответствующими промоторами, RBS и терминатором. См. ссылку 5 в рукописи для подробностей.
Хлорамфеникол	Сигма	C0378
Ампициллин	Сигма	A9518
BD FACSDiva	Бектон Дикинсон		Программное обеспечение для проточной цитометрии версии 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% динатрийфосфат, 0,024% монокалиев фосфат, pH 7,4