Обнаружение экспрессии целевых ферментов в генетически модифицированных бактериальных клетках

Abstract

Источник: Kim, H. и др., Мультиферментный скрининг с использованием высокопроизводительной системы генетического ферментного скрининга. J. Vis. Exp .(2016)

В этом видео демонстрируется метод генетического скрининга для обнаружения экспрессии ферментов с использованием метагеномных фосмидных библиотек и хромогенных субстратов. Потоковая цитометрия выявляет и изолирует отдельные клетки, образующие цветные продукты, что позволяет проводить высокопроизводительный отбор активных ферментных клеток.

Protocol

1. Подготовка Метагеномной библиотеки с помощью системы генетического ферментного скрининга для обнаружения p-нитрофенола (pNP) (pNP-GESS)
   1. Постройте метагеномную библиотеку в Escherichia coli с фосмид-вектором, используя набор для производства библиотеки фосмидов.
   2. Аликвот 100 мкл библиотеки для хранения при −70 °C, что является источником метагеномных библиотечных ячеек.
      ЗАМЕТКА: Оптическая плотность образца, измеренного на длине волны 600 нм (_{OD 600}) из этого библиотечного фонда, составляет примерно 100.
   3. Разморозить 100 мкл стандартной метагеномной библиотеки на льду и инокулять в колбу объемом 500 мл, содержащую 50 мл Лурия-Бертани (LB) и 12,5 мкг/мл хлорамфеникола, после чего инкубировать при 37 °C в течение 2 часов.
   4. Соберите клетки в конической трубке объемом 50 мл путём центрифугации при 1000 x g в течение 20 минут при 4 °C.
   5. Быстро суспензируйте гранулы в 50 мл ледяной дистиллированной воде (DW) и снова центрифугуйте при температуре 1000 x g на 20 минут при 4 °C.
   6. Суспензируйте гранулу в 50 мкл ледяной температуры DW с 10% (v/v) глицерина. Используйте 50 мкл этой ячейки аликвота для электропорации.
   7. Смесь электрокомпетентных элементов 50 мкл и pGESS(E135K) ДНК (100 нг) поместите в ледяную электропорационную кювету и электропоратируйте (1,8 кВ/см, 25 мкФ) смесь.
   8. Быстро добавьте 1 мл супер-оптимального бульона с катболитной репрессионной средой (SOC) и аккуратно зафиксируйте клетки.
   9. Переместите клетки в трубку с круглым дном объёмом 14 мл с помощью пипетки и инкубируйте при 37 °C в течение 1 часа.
   10. Распределить 500 мкл восстановленных клеток на пластину LB размером 20 x 20 см, содержащую 12,5 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл ампициллина. Инкубировать тарелку при 30 °C в течение 12 часов.
   11. Соскребите колонии с помощью скребка и соберите клетки в коническую трубку объёмом 50 мл с использованием среды хранения клеток.
   12. Центрифугировать при 1000 г в течение 20 минут при 4 °C. Повторно суспензировать гранулу в 10 мл ледяной ячейки для OD₆₀₀ от 100.
   13. Аликвот 20 мкл элементов для хранения при −70 °C.
        
2. Удаление ложноположительных результатов из метагеномной библиотеки
   1. Разморозить стандартные метагеномные библиотеки клетки (начиная с шага 1.13), содержащие метагеномную ДНК, фосмид и pGESS(E135K), на льду.
   2. Инокуляция 10 мкл клеток в 2 мл LB с 50 мкг/мл ампициллина и 12,5 мкг/мл хлорамфеникола в 14-мл круглодонной трубке. Инкубировать при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 4 часов.
   3. Тем временем включите машину для сортировки клеток с флуоресценцией (FACS) и откройте стандартное программное обеспечение FACS. Используйте следующие параметры: диаметр наконечника сопла — 70 мкм; чувствительность прямой области рассеяния (FSC-A), 300 V-логарифмическое усиление; чувствительность боковой области рассеяния (SSC-A), 350 В логарифмическое усиление; чувствительность к области изотиоцианата флуоресцеина (FITC-A), амплификации 450 V-логарифмической амплификации; пороговый параметр, значение FSC-A 5.
      ЗАМЕТКА: Типичные настройки приведены для устройства FACS, указанных в Таблице материалов. Настройте настройки для других устройств FACS.
   4. Разбавить клетки метагеномной библиотеки с шага 2.2, добавив 5 мкл образца в 5-мл пробирку с круглым дном с 1 мл физиологического раствора (PBS).
   5. Размещённый образец библиотеки поместите на порт загрузки инструмента FACS и нажмите кнопку «Загрузить» на панели получения программного обеспечения FACS.
   6. Отрегулируйте частоту событий до 1 000 - 1 500 событий в секунду, нажав и управляя кнопками Flow Rate на панели управления.
   7. Создайте график рассеяния с масштабированием логарифма FSC-A и SSC-A на глобальном рабочем листе, нажав кнопку Dot Plot на панели инструментов. Настройте элемент рассеяния R1, чтобы охватить синглетные события (популяция бактерий) с помощью кнопки Polygon Gate на панели инструментов.
   8. Нанесите гистограмму с количеством ячеек и логарифмированным FITC-A на рабочем листе, нажав кнопку Гистограмма. Затем отрегулируйте напряжение FITC через вкладку «Настройки цитометра» в окне контроля инспектора так, чтобы пик колоколообразного распределения был менее 10² FITC-A.
   9. Создайте FSC-A с логарифмированным масштабированием по сравнению с логарифм FITC-A, нажав кнопку Dot Plot на глобальном рабочем листе. Установите сортировочный элемент R2 на графике с помощью кнопки Polygon Gate на панели инструментов так, чтобы элементы находились в пределах +5% и -5 % клеток от центра распределения (всего 10% ячеек вокруг вершины колоколообразной кривой).
   10. Разместите сборную трубку с 1,2 мл LB с 50 мкг/мл ампициллина и 12,5 мкг/мл хлорамфеникола на выходе прибора FACS и выделите 10^{из 6} элементов, удовлетворяющих как элементы R1, так и R2.
   11. Снимите сборную трубку, крышку и аккуратно создайте вихрь.
        
3. Скрининг метагеномных ферментов
   1. Инкубировать отсортированные клетки (начиная с шага 2.11) при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин, пока_{OD 600} не достигнет 0.5.
   2. Добавьте индукционный раствор с 1 мкл для усиления внутриклеточного количества копий фосмид. Инкубировать клетки ещё 3 часа при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин.
   3. Для подготовки клеток к сортировке добавьте 0,5 мл культивируемых клеток и соответствующий субстрат (p-нитрофенилацетат, p-нитрофенил-β-D-целлобиозид или фенилфосфат) в круглодонную трубку объемом 14 мл при конечной концентрации 100 мкм.
      1. Для контрольного образца добавьте 0,5 мл культивированных клеток с шага 3.2 в 14-мл пробирку с круглым дном. Добавьте тот же объём PBS, что и объём субстрата, в шаге 3.3.
   4. Инкубировать оба образца при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 3 часов.
   5. Тем временем подготовьте машину FACS с теми же конфигурациями, что и Step 2.3.
   6. Добавьте 5 мкл клеток (для сортировки) и контрольных клеток в две трубки с круглым дном по 5 мл с 1 мл PBS соответственно.
   7. Поставьте трубку с управляющими элементами на порт загрузки FACS и нажмите кнопку Load на панели приобретения программного обеспечения FACS. Отрегулируйте скорость событий до 1 000 - 3 000 событий в секунду, управляя кнопками Flow Rate на панели управления.
   8. Создайте логарифмированный график рассеяния FSC-A против SSC-A с логарифмическим масштабированием, нажав кнопку Dot Plot на глобальном листе программы, и настройте элемент рассеяния R1, чтобы охватить синглетные события (популяция бактерий) с помощью кнопки Polygon Gate на панели инструментов.
   9. Создайте логарифмированный график рассеяния FSC-A и логарифмированного FITC-A, нажав кнопку Dot Plot на рабочем листе, и установите сортировочный элемент R2 на графике с помощью кнопки Polygon Gate на панели инструментов, чтобы в элементе R2 было обнаружено менее 0,1 % отрицательных ячеек.
   10. Замените контрольную пробирку на сортировочную пробирку и регулируйте частоту событий до 1000–3000 событий/сек, управляя кнопками Flow Rate на панели управления.
   11. Поставьте сборную трубку с 0,5 мл LB на выходе прибора FACS и выделите 10^{из 4} ячеек, удовлетворяющих как элементы R1, так и R2.
       ЗАМЕТКА: Критерий сортировки может варьироваться от верхних 0,1% до 5% от FITC-A в воротах R2. В этом протоколе верхние 1% клеток были собраны как положительные.

Materials