In vitro Модель партийной культуры, имитирующая брожение кишечника с помощью микробиоты кишечника человека

Аннотация

Источник: Ахмади, С. и др. Модель партийной культуры in vitro для оценки влияния интервенционных схем на микробиоту фекалов человека. J. Vis. Exp .(2019).

В этом видео демонстрируется метод моделирования микробной ферментации кишечника путём инкубации образцов калов с пищевыми ферментируемыми волокнами в анаэробных условиях для изучения производства метаболитов микробиотой кишечника.

Протокол

Все процедуры, связанные с сбором образцов, были выполнены в соответствии с руководящими принципами института IRB.

ОСТОРОЖНОСТЬ: Ознакомьтесь с соответствующими Информационными листами по безопасности материалов и следуйте инструкциям и рекомендациям для соответствующего обучения по биобезопасности уровня 2 (BSL-2). Соблюдайте все этапы культивирования в соответствии со стандартными правилами биобезопасности и используйте шкаф BSL-2 с асептическими условиями. Кроме того, образцы кала из разных моделей и у людей могут иметь потенциальный риск распространения микробных заболеваний. Немедленно обратитесь за медицинской помощью в случае травмы или инфекции. Кроме того, использование образцов человеческого и животного кала должно быть одобрено институциональными этическими комитетами и должно соответствовать протоколам использования образцов и информации о испытуемых.

1. Подготовка культурных медиа

1. Подготовка культурных сред, подготовка девяти типов бульевых растворов:
   1. Раствор A (1 000 мл): растворить 5,4 г хлорида натрия (NaCl), 2,7 г дигидрофосфата калия (KH₂PO₄), 0,16 г хлорида кальция (CaCl₂·2H₂O), 0,12 г гексагидрат хлорида магния (MgCl₂·_{6H 2}O), 0,06 г тетрагидрата хлорида марганца (MnCl₂·4H₂O), 0,06 г гексагидрат кобальтового хлорида (CoCl₂·_{6H 2}O) и 5,4 г сульфата аммония (_{NH 4})2SO₄ в деионизированной воде, что приводит к общему объёму 1 000 мл.
   2. Раствор B (1 000 мл): Растворить 2,7 г фосфата калия-водорода (_{K 2HPO 4}) в деионизированной воде для получения общего объёма до 1000 мл.
   3. Раствор микроэлементов (1 000 мл): растворить 500 мг дигидрата динатрия этилендиамина-тетраацетата (Na₂EDTA), 200 мг гептагидрата сульфата железа (_{FeSO 4}·7H₂O), 10 мг гептагидрат сульфата цинка (_{ZnSO 4}·7H₂O), 3 мг тетрагидрата хлорида марганца (II) (MnCl₂·4H₂O), 30 мг фосфорной кислоты (H₃PO₄), 20 мг CoCl₂·6H₂O, 1 мг дигидрата хлорида куприка (_{CuCl 2}·2H₂O), 2 мг гексагидрат никель(II) хлорида (NiCl₂·_{6H 2}O) и 3 мг натриемолибдатного дигидрата (Na_{2MoO 4}·2H₂O) в деионизированной воде с общим объёмом до 1 000 мл.
      ЗАМЕТКА: Этот раствор чувствительный к свету, поэтому храните его в тёмных/чёрных или алюминиевых тюбиках/бутылках.
   4. Растворимый раствор витаминов (1 000 мл): растворить 100 мг тиаминохлорида (тиамин-HCl), 100 мг D-пантотеновой кислоты, 100 мг ниацина, 100 мг пиридоксина, 5 мг P-аминобензойной кислоты и 0,25 мг витамина B12 в деионизированной воде, чтобы общий объём достиг 1 000 мл.
   5. Фолат: биотиновый раствор (1 000 мл): растворить 10 мг фолиевой кислоты, 2 мг D-биотина и 100 мг аммония бикарбоната (_{NH 4}HCO₃) в деионизированной воде до общего объёма 1 000 мл.
   6. Раствор рибофлавина (1 000 мл): растворить 10 мг рибофлавина в растворе 5 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота) (1,19 г/л) для получения общего объёма до 1 000 мл.
   7. Раствор гемина (10 мл): растворить 5 000 мг гемина в растворе гидроксида натрия (NaOH) (0,4 г/л) объёмом 10 мл.
   8. Смесь короткоцепных жирных кислот (10 мл): Объедините 2,5 мл N-валерата, 2,5 мл изовалерата, 2,5 мл изобутирата и 2,5 мл DL-α-метилбутирата.
      ЗАМЕТКА: Этот раствор рекомендуется использовать в вытяжке с дымом, чтобы избежать запаха и паров.
   9. Ресазурин (1 000 мл): растворить 1 г ресазурина в деионизированной воде и сделать общий объём 1 000 мл.
2. Среда, используемая для in vitro анаэробной ферментации
   1. Для приготовления этого материала смешивают 330 мл раствора A, 330 мл раствора B, 10 мл раствора микроэлементов, 20 мл растворимого раствора витаминов, 5 мл фолата: биотинового раствора, 5 мл раствора рибофлавина; 2,5 мл раствора гемина, 0,4 мл смеси короткоцепочечных жирных кислот, 1 мл резазурина, 0,5 г экстракта дрожжей, 4 г карбоната натрия (_{Na 2CO 3}), 0,5 г цистеина HCl-H₂O и 0,5 г триптиказа, а также добавление 296,1 мл дистиллированной воды.
   2. Проверьте pH и убедитесь, что он около 7.0; если нет, отрегулируйте pH с 1 N HCl или 1 N NaOH. Стерилизуйте вакуумной фильтрацией среды с помощью бутылочного фильтра под асептической рабочей станцией.
   3. В качестве альтернативы смешайте все компоненты (кроме растворов витаминов и гемина) и автоклав при 121 °C в течение 20 минут, чтобы остыть до комнатной температуры. Одновременно фильтруйте и стерилизуйте растворы витаминов и гемина с помощью мембранных фильтров диаметром 0,22 мкм и добавляйте их в автоклавную и охлаждённую среду перед разливом.

2. Подготовка анаэробной камеры и необходимых материалов

1. Храните все материалы, растворы и инструменты, необходимые для эксперимента ферментации, внутри анаэробной камеры не менее чем за 48 часов до начала эксперимента, чтобы убедиться, что остатки кислорода, связанные с инструментами и растворимым кислородом в буферах/растворах, будут удалены, а все материалы акклиматизированы к заданным анаэробным условиям.
   ЗАМЕТКА: Материалы, необходимые внутри анаэробной камеры (за 48 часов до начала эксперимента): (i) среда ферментации; (ii) анаэробный раствор (подготовлен в соответствии с разделом 4.1), (iii) вихревой вес, (iv) весы, (v) марля из муслина, (vi) ножницы, (vii) воронка, (viii) трубки объемом 1,5, 2,0, 15, 50 мл, (ix) пипетка (2, 20, 200 и 1 000 мкл) и совместимые наконечники пипет, (x) пушечная пипета и пипетки (5 и 10 мл), (xi) бумажные салфетки, (xii) маркеры, (xiii) подставки для трубок для разных трубок, (xiv) контейнер для отходов, (xv) индикатор кислорода и (xvi) бутылка с 70% этанолом (дезинфицирующее средство).

3. Подготовка трубок и волокон

1. Взвесить 300 мг инулина и перенести в трубку объёмом 50 мл, после чего асептически добавить 26 мл уже подготовленного и хранящегося в анаэробной камере ферментационного материала. Подготовьте по одной пустой пробирке для каждого типа образца кала и экспериментальной пробирки (в зависимости от количества исследуемых соединений) в три экземпляжа.
2. Оставьте эти пробирки внутри анаэробной камеры примерно на 24 часа, чтобы образцы могли увлажниться перед началом эксперимента по ферментации. Убедитесь, что температура трубки на момент инокуляции составляет 37 °C, поэтому поместите трубки в инкубатор, заключённый в анаэробную камеру.

4. Подготовка инокуля

1. Анаэробный раствор разбавления (не менее чем за 48 часов до ферментационного эксперимента): растворить 5 г NaCl, 2 г глюкозы и 0,3 г цистеина-HCl в деионизированной воде и получить общий объём до 1 000 мл. Автоклав и храните его в анаэробной камере не менее чем за 48 часов до использования.
2. Подготовка фекального инокулума (в день эксперимента по ферментации): взвесить 5 г свежего образца фекалий в конической трубке объёмом 50 мл, добавить анаэробный раствор для окончательного объёма 50 мл (1:10 вт/в) и провести вихрь в течение 15 минут или до полной гомогенизации. Профильтруйте гомогенизированную смесь через 4 слоя стерильной марли (автоклавированной) и немедленно используйте её для инокуляции в трубки с материалом.
   ЗАМЕТКА: Образцы фекалий группы участников можно объединить, если цель эксперимента — сравнить влияние конкретного соединения/ингредиента на общее состояние здоровья и заболевшей фекальной микробиоты в целом.

5. Ферментация и отбор проб

1. Подготовьте пробирки в соответствии с разделом 4.2 и инокулятируйте заготовки/контрольные и экспериментальные трубки 4 мл разбавленной и фильтрованной фекальной инокуля. Инкубировать инокуляционные трубки при 37 °C внутри анаэробной камеры. Встряхивайте трубки раз в час, аккуратно переворачивая, чтобы снова взвешивать волокна и инокулум.
2. Собирайте образцы так часто, как нужно, например, раз в час до 0, 3, 6, 9 и 24 часов во время ферментации, доставая образец объёмом 2 мл аликвота в пробирку на 2 мл из соответствующих ферментационных трубок.
3. Измеряйте pH аликвотов с помощью лабораторного pH-метра (непосредственно вставляя pH-электрод в образец); Центрифугуйте оставшийся образец при 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Немедленно заморозьте супернатант и гранулу в жидком азоте, а после быстрого заморозки храните супернатант для анализа SCFA (короткоцепочечных жирных кислот) и гранулу для анализа микробиома при -80 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бикарбонат аммония	Сигма-Олдрич	217255
Сульфат аммония	TGI	C2388	Токсичный
Хлорид кальция дигидрат	Сигма-Олдрич	C3306	Раздражающий
Гексагидрат кобальтозного хлорида	Сигма-Олдрич	255599
Дигидрат хлорида куприда	Acros organics	2063450000	Токсично, раздражающее
Цистеин-HCl	Сигма-Олдрич	C121800
D-биотин	Сигма-Олдрич	B4501
D-пантотеновая кислота	Alfa Aesar	A16609
Дигидрат этилеродиаминетрацетат	Biorad	1610729
DL-α-метилбутират	Сигма-Олдрич	W271918
Гептагидрат сульфата железа	Сигма-Олдрич	F8263	Токсичный
Фолиевая кислота	Alfa Aesar	J62937
Глюкоза	Сигма-Олдрич	G8270
Hemin	Сигма-Олдрич	H9039
Хепес	Alfa Aesar	A14777
Изобутират	Alfa Aesar	L04038
Изовалерат	Alfa Aesar	A18642
Гексагидрат хлорида магния	Сигма-Олдрич	M8266
Тетрагидрат хлорида марганца	Сигма-Олдрич	221279
Ниацин (никотиновая кислота)	Сигма-Олдрич	N4126
Гексагидрат никель(II) хлорида	Alfa Aesar	A14366	Токсичный
N-валерат	Сигма-Олдрич	240370
P-аминобензойная кислота	Депутат Китая	102569	Токсично, раздражающее
Фосфорная кислота	Сигма-Олдрич	P5811
Дигидрофосфат калия	Сигма-Олдрич	P5504
Калий-гидрофосфат	Сигма-Олдрич	1551128
Пиридоксина	Alfa Aesar	A12041
Ресазурин	Сигма-Олдрич	R7017
Рибофлавин	Alfa Aesar	A11764
Углекислый натрий	Сигма-Олдрич	1613757
Хлорид натрия	Биореагенты Fisher	7647-14-5
Гидроксид натрия	Fisher Chemicals	S320
Натрий молибдатный дигидрат	Acros organics	206375000
Тиамин гидрохлорид	Acros organics	148991000
Триптиказа	BD Biosciences	211921
Витамин B12	Сигма-Олдрич	V2876
Экстракт дрожжей	Сигма-Олдрич	70161
Гептагидрат сульфата цинка	Сигма-Олдрич	Z0251
Мембранный фильтр 0,22 мкм
Магнитные очищающие шарики AMPure	Ажанкур
Анаэробная камера с инкубатором	Форма анаэробной системы, Thermo Scientific, США
Бутылочный фильтр	Корнинг
Марля
pH-метр
Вихрь	Термонаучные