Микроаэробная ферментация бамбукового гидролисата Klebsiella pneumoniae

Аннотация

Источник: Wei, D. и др., Производство химикатов Klebsiella pneumoniae с использованием бамбукового гидролисата в качестве сырья. J. Vis. Exp .(2017)

В этом видео демонстрируется микробное превращение бамбуковых сахаров в 2,3-бутандиол путём культивирования Klebsiella pneumoniae в гидролизатной среде в микроаэробных и слабо кислых условиях.

Протокол

1. Производство 2,3-бутандиола Wildtype K. pneumoniae

1. Используйте 3 литра бамбукового гидролизата в качестве растворителя для приготовления среды.
2. Приготовьте ферментационную среду с 4 г/л кукурузного напитка, 2 г/л (_{NH 4})₂SO₄, 6 г/л K_{2HPO 4}, 3 г/л KH₂PO₄ и 0,2 г/л_{MgSO 4}. Регулируйте pH среды на нейтральный, используя 2,5 M NaOH. Используйте биореактор объемом 5 л с 3 л автоклавной ферментационной среды для брожения.
3. Используйте клетки K. pneumoniae , хранящиеся в низкотемпературном холодильнике -80°C.
4. Для культуры семян инкубируют колбу объемом 250 мл, содержащую 50 мл среднего вещества Luria-Bertani (LB) на ночь при 37 °C, с встряхиванием при 200 об/мин. Используйте LB-среду, содержащую 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжей экстракта и 10 г/л NaCl. ЗАМЕТКА: Плотность клеток семенной культуры должна достигать OD 2 (оптическая плотность при 600 нм).
5. Инокулятируйте одну колбу объёмом 50 мл семенной культуры в биореакторе. Поддерживайте культуру при pH 6,0 и 37 °C. Используйте скорость добавления воздуха 2 л/мин и скорость перемешивания 250 об/мин, создавая микроаэробное состояние.
6. Собирайте образцы по 5 мл каждые 2 часа во время ферментации и анализируйте их с помощью жидкой хроматографии высокого давления, чтобы определить химические концентрации в бульоне.
7. Отслеживайте щелочь, добавляемые в биореактор, онлайн с помощью микробной системы топливных элементов/сбора данных или MFCS/DA.
   ЗАМЕТКА: Органические кислоты образуются в процессе ферментации, а NaOH добавляется для поддержания стабильного pH культуры. Объём добавленной щелочи соответствует объёму вырабатываемой кислоты. Когда линия с добавлением щелочи застывает, процесс заканчивается либо из-за истощения источника углерода, либо из-за гибели клеток.

2. Выработка R-ацетоина мутантом K. pneumoniae с помощью budC-мутанта

1. Приготовьте среду для производства ацетоина, содержащую 4 г/л кукурузного напитка, 2 г/л (_{NH 4})₂SO₄, 3 г/л ацетата натрия, 0,4 г/л KCl и 0,1 г/л_{MgSO 4}.
2. Используйте K. pneumoniae-ΔbudC для производства R-ацетоина. Повторяйте шаги 1.4–1.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: budC кодирует 2,3-бутандиолдегидрогеназу. K. pneumoniae-ΔbudC теряет активность 2,3-бутандиолдегидрогеназы и производит R-ацетоин вместо 2,3-бутандиола.
3. Поддерживайте культуру при pH 6,0 и 37 °C. Используйте скорость добавки воздуха 4 л/мин и скорость возбуждения 450 об/мин, аэробное состояние.
   ЗАМЕТКА: Приём кислорода выше, чем при производстве 2,3 бутандиола.
4. Проанализируйте образцы в соответствии с шагом 1.6.

3. 2-Производство кетоглюконовой кислоты мутантом бутона K. pneumoniae

1. Для производства 2-кетоглюконовой кислоты используйте ту же среду, что и для производства R-ацетоина.
2. Используйте K. pneumoniae-ΔbudA для производства 2-кетоглюконовой кислоты. Повторяйте шаги 1.4–1.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: будка А кодирует α-ацетолактат декарбоксилазу. K. pneumoniae-ΔbudA теряет активность α-ацетолактата декарбоксилазы и производит 2-кетоглюконовую кислоту, используя глюкозу в качестве субстрата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: синтез 2-кетоглюконовой кислоты — это процесс, зависящий от кислотных условий. Разработана двухступенчатая ферментация для производства двухкетоглюконовой кислоты; На первом этапе семянная культура инъекциируется в биореактор.
3. Поддерживайте культуру при pH 7,0 и 37 °C. Используйте скорость добавки воздухом 4 л/мин и скорость перемешивания 500 об/мин.
   ЗАМЕТКА: В таких условиях клетки растут очень быстро (плотность достигает OD 7 примерно за 4 часа). Затем ферментация переходит ко второй стадии, во время которой pH культуры снижается до 5,0. Кислота не добавляется; органические кислоты, образующиеся в культуре, естественным образом приводят к снижению pH. В таких кислых условиях рост клеток останавливается, но синтезируется 2-кетоглюконовая кислота, которая накапливается в бульоне.
4. Проанализируйте образцы в соответствии с шагом 1.6. Использование гидролиза бамбука в качестве источника углерода.
   ЗАМЕТКА: Глюкоза в среде превращается в 2-кетоглюконовую кислоту, а ксилоза — в ксилоновую кислоту. Таким образом, получается смесь 2-кетоглюконовой и ксилоновой кислот.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоклав	SANYO	3780
Биореактор	Sartorius stedim biotech	Bostat Aplus
Агитатор	IKA	RW 20
Высокопроизводительная жидкостная хроматографическая система	Корпорация Симадзу	20AVP
Бамбуковый порошок	Приобретено в провинции Чжэцзян, Китай		Номер сетки — 50
Целлюлаза	Youtell Biochemical, Шаньдун, Китай		200 ПФУ/мл