$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Экстракция метаболитов
- Оттаивать образцы на влажном льду и разрушать работу клеток в гомогенизаторе с четырьмя взрывами по 30 секунд при 6000 об/мин, с 2-минутным периодом охлаждения на сухом льду между циклами.
- Очищайте лизаты в течение 15 минут в предварительно охлажденной микроцентрифуге на максимальной скорости (то есть 18 213 x g при ≤4 °C).
- Перенесите супернатант в чистую микроцентрифуговую трубку.
- С помощью микропипетки перенесите небольшую часть образца в микроцентрифугную пробирку для количественной оценки остаточного содержания пептидов на этапе 2; Остальное храните при -80 °C.
ЗАМЕТКА: Объём зарезервированного образца варьируется в зависимости от анализа бицинхониновой кислоты (BCA), используемого на шаге 2.1. Этот образец следует хранить на влажном льду для немедленного анализа или заморозить при -80 °C.
2. Анализ на бицинхониновую кислоту (BCA)
- Проведите анализ BCA по рекомендации производителя набора, используя образцы из шага 1.4 для определения остаточной концентрации пептида для каждого образца.
3. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS)
- Смешайте 75 мкл экстракта Staphylococcus aureus (S. aureus ) с 75 мкл растворителя LC-MS B, приготовленного на этапе 1.4.
- Vortex для смешивания и вращения при 13 000 x g в течение 5 минут.
- Поместите 100 мкл супернатанта в флакон жидкой хроматографии (LC) и закройте её. Убедитесь, что в образце не задерживаются пузырьки воздуха.
- Загрузите флаконы LC на автосэмплер LC-MS и отредактируйте список работы в программе «Offline Worklist Editor».
- Заполните столбцы «Название образца» (например, wild-type-1), «Позиция образца» (например, P1-A1), «Метод» (например, метод с муравьиной кислотой) и «Data File» (например, wild-type-1). Нажмите кнопку «Сохранить рабочий список». Откройте программное обеспечение «Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation» и введите ранее сохранённый рабочий список. Нажмите кнопку «Начать запуск рабочего списка», чтобы начать непрерывное измерение LC-MS.
- Разделить образцы на колонке, свяжить столбец с спектрометром времени полёта (TOF) и связать TOF-спектрометр с системой LC. Используйте градиент подвижной фазы следующим образом: 0-2 мин, 85% растворителя B; 3-5 минут, растворитель B 80%; 6-7 минут, 75% растворителя B; 8-9 минут, растворитель B 70%; 10-11,1 мин, 50% растворителя B; 11,1–14 мин, растворитель B 20%; и 14,1–24 минуты, 5% растворителем B; завершается 10-минутным периодом восстановления при 85% растворителя B и расходе 0,4 мл мин-1.
- С помощью изократического насоса вводите в пробег эталонный массовый раствор для одновременной калибровки осей массы.
ЗАМЕТКА: Этот этап основан на стандартном руководстве по спектрометру TOF.- Используйте смесь уксусной кислоты D4 и гексакис (1H, 1H, 3H-тетрафторопрокси) фосфазина в качестве эталонного массового раствора для проведения калибровки в реальном времени. Для инфузии используйте изократический насос с расходом 2,5 мл мин-1 .
4. Пакетная коррекция ионных счётов
- Назначьте любой образец в качестве эталонного образца для пакетной коррекции (например, дикий тип, реплика 1).
- Вычислите сумму ионного количества для всех метаболитов в эталонном образце. Повторите этот расчёт для всех образцов.
- Делим общее количество ионов каждого образца на общее количество ионов в эталонном образце, чтобы получить соотношение.
- Разделите количество ионов для каждого метаболита в образце на соотношение образца/референс, чтобы получить партийно скорректированное количество ионов для каждого метаболита.
5. Нормализация пептидов
- Разделите партийно скорректированные значения количества ионов для каждого образца, полученного на шаге 4, на концентрацию пептидов, определённую с помощью анализа BCA на шаге 2, чтобы получить нормированное значение для каждого метаболита.
ЗАМЕТКА: Нормализованные, партийно-скорректированные количество ионов для каждого метаболита, полученные на шаге 5.1, можно напрямую сравнивать между штаммами и подвергать статистическому анализу (например, U-тест Манна-Уитни). Альтернативно, метаболит, известный как неизменный либо по методу лечения, либо по генетическому фону, может использоваться в качестве нормализатора для выявления изменений, вызванных разложением метаболитов. Включение известного количества L-норвалина или глутаровой кислоты в буфер экстракции может быть использовано для коррекции потерь во время обработки образца.