Мониторинг роста бактерий в различных составах сред с помощью автоматизированного микробиореактора

Аннотация

Источник: Хеммерих, Дж. и др. Протокол оптимизации производства гетерологичного белка с использованием технологии автоматизированных микробиореакторов. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео демонстрируется использование автоматизированного микробиореактора для мониторинга роста бактерий и секреции флуоресцентного белка в ответ на различные формулы среды. Генетически модифицированная бактерия, экспрессирующая секреторный флуоресцентный белок, культивируется в ходе антибиотикового отбора и инокуляется в разнообразные по питательным веществам колодцы. Оптические измерения плотности и флуоресценции клеток в реальном времени позволяют сравнительно анализировать производство белка при различных условиях роста.

Протокол

1. Подготовка материалов и процедуры определения
ЗАМЕТКА: Рекомендуется определить и закрепить экспериментальные методы на детальном уровне. Эта стандартизация гарантирует, что различные результаты можно проследить до внутренней биологической изменчивости или различных составов среды. ​
ЗАМЕТКА: Медиа-стоковые решения: Подготовьте индивидуальные стоковые решения для всех исследуемых компонентов медиа. Подготовьте высококонцентрированные запасы для разбавления различных объёмов для всех компонентов. Это означает, что после объединения всех запасных решений на их максимальном объёме согласно проектному плану это не может превышать итоговый объём культивации, см. абзац «Список пипетирования средних запасных растворов» шаг 1.3.3. Если добавление высококонцентрированного раствора приводит к очень низкому объёму добавления, например, < 1/100 от итогового объёма культивации, раствор набора разбавляется соответственно. Например, в этом исследовании объём пипетирования менее 10 мкл был определен как невыполним. Обычно растворы из микроэлементов концентрируются до 1000 раз относительно конечной стандартной концентрации в среде. Выгодно концентрировать компоненты среды как кратные (X-кратные) относительно концентраций в эталонном рецепте. Таким образом можно избежать невозможных объёмов пипетирования дробных десятичных знаков. Подробные рецепты всех стоковых растворов среды CgXII приведены в дополнительном документе.

1. Рабочий банк ячейок (WCB)
Примечание: для каждого эксперимента по росту используется один WCB аликвот. Если требуется больше аликвотов, используйте 100 мл инфузии мозгового сердца (BHI) в 1000 мл флаконах с защитой или инокуляцию в несколько коктейлей, которые собираются перед добавлением раствора глицерина.

1. Подготовьте отдельные колонии рекомбинантного экспрессионного штамма C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 на агарных пластинах (37 г/л порошок BHI, 20 г/л агар, 25 мг/л канамицин). Материал обшивки может быть получен либо при свежем превращении, либо из криоконсервированного аликвота. Инкубировать при 30 °C до появления отдельных колоний; Обычно это занимает от одного до двух дней.
2. Инокуляция в культуру шейкер-фляжки (среда BHI объемом 50 мл с канамицином 25 мг/л, 500 мл фляжки с перекрытием, 250 об/мин, диаметр встряхивания 25 мм, 30 °C) материалом для колонии и инкубировать на ночь (примерно 16 часов).
3. Объедините один объём суспензии клетки с одним объёмом раствора стерильного глицерила 500 г/л и распределите в 2 мл аликвот в стерильных криоконсервационных флаконах. Храните при -80 °C.

2. Протокол выращивания MBR
Заметка: Для используемой системы MBR BioLector в этом исследовании измерения интенсивности являются рассеянный свет (биомасса) и флуоресценция GFP, для которых требуется определённое значение усиления. Чем выше коэффициент усиления, тем выше усиливается оптический сигнал; Именно поэтому рассеянный свет и флуоресценция измеряются в произвольных единицах (A.U.). Определить подходящие значения усиления для обнаружения биомассы и GFP в предварительных экспериментах, а также подходящую частоту встряхивания и объём заполнения, чтобы избежать ограничения кислорода при высоких концентрациях биомассы на поздних этапах процесса. Используемые условия выращивания («Flowerplates», то есть цветочные 48-колодцевые MTP, частота встряхивания 1200 об/мин, объём заполнения 1000 мкл, 10 г/л глюкозы как основной источник углерода) обеспечивали выращивания с неограниченным содержанием кислорода. Для максимальных скоростей переноса кислорода, возникающих при других сочетаниях объёмов заполнения и частот встряхивания в цветочных MTP с 48 колодцами, доступны технические таблицы от поставщика. Также могут возникать дефекты роста отдельных культур из-за недостаточного количества вторичных субстратов (например, азота, микроэлементов). Поэтому проверьте концентрацию биомассы в конце культивации. В этом исследовании таких эффектов роста не наблюдалось.

1. Определим протокол культивации для системы MBR («BioLector») следующим образом:
2. Набор фильтров 1: Биомасса, усиление 14. Набор фильтров 2: pH, усиление предустановлено. Набор фильтров 3: pO2, усиление предустановлено. 4: GFP, прирост 80.
3. Частота встряхивания: 1 200 об/мин.
4. Температура: 30 °C.
5. Время цикла: 15 минут.
6. Время эксперимента: вручную (культивация не останавливается автоматически).

3. Составление списка пипетирования среднезапасного раствора
Заметка: Практически любая система робота для обработки жидкостей способна считывать действия пипетирования из внешних файлов. По сути, минимальная необходимая информация — это объём передачи и положение источника реагента, а также назначение каждого из них, представленное положением лабораторной изделия на роботизированной палубе и конкретной полостью внутри лабораторной пластины. Однако необходимо учитывать разные синтаксисы для различных систем обработки жидкости. Рисунок 1 показывает пример структуры файла для используемой системы пипетирования в этом исследовании.

1. В каждую культивационную скважину пипетируют четыре типа запасных растворов:

1. Стоковые решения различных компонентов среды («вариационные запасы»).
2. Вода, чтобы компенсировать разные совокупные объёмы вышеуказанных запасов.
3. Стандартное решение («Rest Stock»), содержащее все фиксированные компоненты. Этот бульонный раствор может быть составлен из запасов, содержащих различные компоненты, которые, например, хранятся при разных температурах или стерилизуются разными методами.
4. Инокулум, который следует добавить в качестве последнего компонента и положить на рабочий стол непосредственно перед добавлением, чтобы избежать оседания клеток.

2. На одну скважину для культивации рассчитать объемы для передачи для всех компонентов среды по следующим параметрам:

Объем, который должен быть добавлен для некоторых вариационных акций , может быть равен нулю, то есть если этот конкретный компонент опущен.

3. Пересмотрите все рассчитанные тома Vi для подходящих чисел. Увеличение объема пипетирования по ступеням не должно быть слишком мало. При необходимости корректируйте концентрацию вариационных запасов. Например, минимальный объём пипетирования здесь был определен как 10 мкл, а минимальный прирост — как 5 мкл. В целом эти объёмы должны определяться на основе экспериментально определённой точности и точности для используемой станции обработки жидкости.

4. Рассчитать объём запаса с фиксированными компонентами для всех скважин следующим образом:

где используется максимальный кумулятивный объём вариационного запаса . Следовательно, рассчитайте требуемые концентрации фиксированных компонентов в Rest Stock следующим образом:

Подготовьте запасы для отдыха соответственно.

5. На одну скважину для культивации рассчитывайте объём добавленной воды следующим образом:

6. По каждой культивирующей скважине перечислите все объемы, которые должны быть добавлены, в следующем порядке добавления: V_H2O, V_RestStock, V_i,_{V Inok}. Отформатируйте список пипетирования согласно спецификациям станции обработки жидкостей, как, например, показано на рисунке 1.

2. Выращивание семян, автоматизированная подготовка среды и запуск основной культуры

1. Создайте протокол для робота для обработки жидкостей. См. рисунок 2 и рисунок 3 для примера протокола системы «Janus», реализованного в соответствующем программном обеспечении «WinPREP». Протокол должен учитывать следующие аспекты:

1. Включить достаточное время работы стерильного корпуса перед подготовкой материала.

2. Включать первоначальную тщательную чистку и промывку всех наконечников пипетирования и трубок.

3. Выбирайте подходящие лабораторные контейнеры для наличных решений. Здесь для хранения вариационных запасов подходят глубокие пластины скважины с 12 колоннами, так как все восемь наконечников пипетирования могут погружаться параллельно в колонны скважин. Это значительно ускоряет подготовку СМИ. Если реагентные трубки объёмом 15 мл или 50 мл используются в качестве резервуаров, только один кончик пипетирования может одновременно погрузиться в него. Для других запасов, таких как вода и Rest Stock, используются желобы объемом 100 мл, так как такие решения требуют больших объёмов запасов.

4. Обеспечить достаточный общий объём для каждого раствора запаса, чтобы компенсировать объемы отходов, смещение высоты пипетирования и т.д.

5. Вставьте пользовательский запрос перед этапом прививки, убедившись, что этот этап выполнен непосредственно перед процедурой посева семян.

2. Готовьте все растворы для запасов в стерильном порядке и храните до использования в соответствующих контейнерах, например, стерильных пробирках объёмом 15 мл и 50 мл.
3. Простерилизуйте плиты глубоких скважин для хранения раствора на рабочем столе, например, протирая 70% этанолом, а затем сушите в ламинарной вытяжке.
4. Начинайте культуру семян с инокуляции среды BHI объемом 50 мл с 25 мг/л канамицина одним аликвотом из WCB. Перед выращиванием MBR подготовьте свежий, жизненно важный инокулум из экспоненциально растущих семенных культур в достаточном объёме.
5. Разместите всю необходимую лабораторную посуду на роботизированный рабочий стол и вылейте растворы в соответствующую лабораторную посуду.
6. Запустите роботизированный рабочий процесс подготовки среды, чтобы последний этап (инокуляция) был достигнут вовремя с началом культуры семян. Общее время выполнения роботизированного рабочего процесса необходимо оценить заранее. Здесь общее время работы составляло примерно 1,5 часа.
7. Снимите пробу семенной культуры примерно через 2 часа, затем каждый час, чтобы отслеживать рост по оптической плотности (_{OD 600}). Примерно через 5 часов культура достигает 3-4_{OD 600} и используется для вакцинации основных культур.
8. Поместите семянную культуру на рабочий стол с жидкостной обработкой и продолжите процесс подготовки среды. Культивирование тюленей MTP после инокуляции.
9. Поместите запечатанный MTP для культивации в устройство BioLector и начните заранее определённый протокол культивации.
10. При необходимости утилизировать оставшиеся запасные растворы в соответствии с нормами биобезопасности и засеять культуру с роботизированного рабочего стола. Очистите многоразовую лабораторную посуду и начните протокол дезактивации жидкостного обработчика.

Результаты

Рисунок 1: Скриншот из списка пипетирования объёма для анализа чувствительности. Записи в первом столбце присваивают уникальный идентификатор всем объёмам строки; этот идентификатор — это номер скважины MTP целевого культивирующего MTP на р...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BioLector	M2P-Labs	G-BL-100
Цветочная пластина	M2P-Labs	MTP-48-BOH	Для выращивания в устройстве BioLector
Уплотнительная фольга	M2P-Labs	F-GP-10	Стерильная герметизация для Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	н/д	Свободно доступно, требуется установка MATLAB
Робот-пипетатор Janus	Перкин Элмер	н/д	Включает установку программного обеспечения «WinPrep»
Микропластина с глубиной 12 колонок скважины	E&K Scientific	EK-2034	Контейнер для средних запасных решений
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	н/д	н/д	Несёт плазмиду pEKEx2 с слиянием гена GFP и сигнального пептида PhoD из B.subtilis в качестве вставки для экспрессии. Плазмида обеспечивает устойчивость к канамицину. Описано и опубликовано Мейснером и др. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)