В этом видео демонстрируется криоконсервация штаммов цианобактерий путём сочетания концентрированных клеточных суспензий с глицерилом или DMSO и их хранения при низких температурах, что позволяет долгосрочно поддерживать жизнеспособные культуры для фотосинтеза и генетических исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Долгосрочное криоконсервирование штаммов цианобактерий с использованием глицерина или диметилсульфоксида
502 просмотров
⸱
28 ноября 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
1. Подготовка культурных медиа
- Подготовьте средний материал BG11
- Подготовьте прикладные растворы из 100x BG11, микроэлементов и железного приклада (Таблица 1).
- Подготовьте отдельные растворы фосфатного запаса, буфера азота натрия (Na 2CO3) N-[Tris(гидроксиметил)метил] -2-аминоэтансульфоновая кислота (TES) и бикарбоната натрия (NaHCO 3) (Таблица 1).
- Автоклав фосфатов и запасов Na2CO3 . Фильтруйте-стерилизуйте буфер TES иNaHCO 3 с фильтрами 0,2 мкм.
- Приготовьте BG11, смешав 976 мл воды, 10 мл 100x BG11, 1 мл микроэлементов и 1 мл железного бульона, и автоклавуйте раствор. После охлаждения раствора добавьте 1 мл фосфатного бульона, 1 мл бульонаNa2CO3 и 10 мл NaHCO3.
- Для твердой среды BG11 добавьте 15 г агар и 700 мл воды в одну колбу. Во вторую колбу добавьте 3 г тиосульфата натрия (Na 2S2O3), 226 мл воды, 10 мл 100x BG11, 1 мл микроэлементов и 1 мл железного бульона. Автоклав — оба решения. После охлаждения до комнатной температуры их смешайте и добавьте 1 мл фосфатного бульона, 1 мл бульонаNa 2CO3 , 10 мл буфера TES и 10 млNaHCO 3.
ЗАМЕТКА: Растворы готовят отдельно, чтобы избежать осаждения определённых солей.
- Для выбора сахарозы приготовьте раствор сахарозы 50% (с в/в). Раствор простерилизуйте фильтром 0,2 мкм и добавьте в BG11 (100 мл сахарозы 50% до 900 мл BG11) для получения пластин сахарозы BG11/5%.
ЗАМЕТКА: Не добавляйтеNaHCO 3 на пластины сахарозы BG11/5%. ДобавьтеNa 2CO3 как обычно. - Для культивирования Synechococcus добавьте 10 мл 1 М 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота, N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N′-(2-этансульфоновая кислота) (HEPES) и 1 мл витамина B12 (Таблица 1) до 1 л среды BG11.
ЗАМЕТКА: Трансформация штаммов, культивируемых в коммерчески доступных средах BG11, значительно менее эффективна, чем в рецептах BG11, описанных здесь, и поэтому не рекомендуется.
2. Длительное хранение штаммов
- Создайте свежую культуру сорта, инокуляцируя петлю клеток в 30-50 мл среды BG11. Выращивайте культуру в течение 3-4 дней доOD 750nm = 0,4–0,7.
- Промыйте клетки один раз BG11 и снова суспензируйте в ~2 мл BG11.
- Добавьте 0,8 мл концентрированных клеток в одну трубку. Затем добавьте 0,2 мл 80% фильтрованного глицерила.
- По необходимости: добавьте 0,93 мл концентрированных клеток в другую трубку. Добавьте в эту пробирку 0,07 мл DMSO.
ОСТОРОЖНОСТЬ: ДМСО токсична и должна обращаться с ним с соответствующей защитой. - Храните обе трубки при -80 °C. Для восстановления штаммов удалите трубку и соскребите некоторые клетки тупой зубочисткой на агаровой пластине без антибиотиков. Выйдите как обычно, используя стерильную петлю.
Таблица 1: Растворы, используемые в данном исследовании
| Рецепты бульонного раствора | |
| Химический | Количество (g) |
| 100x BG11 (на L) | |
| NaNO3 | 149.6 |
| MgSO4.7H 20 | 7.49 |
| CaCl2.2H 2O | 3.6 |
| Лимонная кислота | 0.6 |
| Добавьте 1,12 мл 0,25 M Na2EDTA, pH 8,0 | |
| 0,25 M Na2EDTA, pH 8,0 (на 100 мл) | |
| Na2EDTA | 9.3 |
| Микроэлементы (на 100 мл) | |
| H3BO3 | 0.286 |
| MnCl2.4H 20 | 0.181 |
| ZnSO4.7H 20 | 0.022 |
| Na2MoO 4.2H 2O | 0.039 |
| CuSO4.5H 20 | 0.008 |
| Co(NO 3)2.6H 20 | 0.005 |
| Железный бульон (на 100 мл) | |
| Цитрат железного аммония | 1.11 |
| Фосфатный бульон (на 100 мл) | |
| K2HPO 4 | 3.05 |
| Na2CO3 запаса (на 100 мл) | |
| Na2CO3 | 2 |
| Буфер TES, pH 8,2 (на 100 мл) | |
| TES | 22.9 |
| NaHCO 3 запаса (на 100 мл) | |
| NaHCO3 | 8.4 |
| HEPES, pH 8,2 (на 500 мл) | |
| HEPES | 119.15 |
| Витамин B12 (на 50 мл) | |
| Цианокобаламин | 0.02 |
| Luria Bertani media (на 500 мл) | |
| Бульон Лурия Бертани | 12.5 |
| 1 M MgCl2 (на 100 мл) | |
| MgCl 2.6H 2O | 20.33 |
| Раствор A (на 200 мл) | |
| MnCl2.4H 20 | 0.395 |
| CaCl2.2H 2O | 1.47 |
| 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота-гидрат, 4-морфолинеэтанасульфоновая кислота (MES) | 0.4265 |
| Раствор A + глицерин | |
| 10 мл раствора A | |
| 1,5 мл глицерина | |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| NaNO₃ | Сигма | S5506 | |
| MgSO₄·7H₂O | Сигма | 230391 | |
| CaCl₂ | Сигма | C1016 | |
| Лимонная кислота | Сигма | C0759 | |
| Na₂EDTA | Рыбак | EDT002 | |
| H₃BO₃ | Сигма | 339067 | |
| MnCl₂·4H₂O | Сигма | M3634 | |
| ZnSO₄·7H₂O | Сигма | Z4750 | |
| Na₂MoO₄·2H₂O | Сигма | 331058 | |
| CuSO₄·5H₂O | Сигма | 209198 | |
| Co(NO₃)₂·6H₂O | Сигма | 239267 | |
| Цитрат железного аммония | Сигма | F5879 | |
| K₂HPO | Сигма | P3786 | |
| Na₂CO₃ | Рыбак | SODC001 | |
| TES | Сигма | T1375 | |
| NaHCO₃ | Рыбак | SODH001 | |
| HEPES | Сигма | H3375 | |
| Цианокобаламин | Сигма | 47869 | |
| Na₂S₂O₃ | Сигма | 72049 | |
| Бакто агар | BD | 214010 | |
| Сахароза | Рыбак | SUC001 | |
| Чашка Петри 90 мм с тройной вентиляцией | Грейнер | 633185 | |
| 0,2 мкм фильтры | Сарториус | 16534 | |
| Конические колбы объемом 100 мл | Пирекс | CON004 | |
| Parafilm M 100 мм x 38 м | Бемис | FIL003 | |
| Полимераза высокой точности ДНК Фузиона | Фьюзион | F-530 | |
| Агароза | Мелфорд | MB1200 | |
| Набор для очистки ДНК | MoBio | 12100-300 | |
| Рестрикционные эндонуклеазы | КЛЮВ | ||
| Лигаза T4 | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Бульон Лурия Бертани | Инвитроген | 12795-027 | |
| МЧС | Сигма | M8250 | |
| Канамицинсульфат | Сигма | 60615 | |
| Ампициллин | Сигма | A9518 | |
| Минипреп-комплект GeneJET для плазмиды | Thermo Scientific | K0503 | |
| Трубка с круглым дном объемом 14 мл | BD Falcon | 352059 | |
| Гибкая ДНК-полимераза GoTaq G2 | Promega | M7805 | |
| Стеклянные бусины диаметром 425–600 мкм | Сигма | G8772 | |
| Глицерин | Сигма | G5516 | |
| ДМСО | Сигма | D8418 | |
| Люминесцентные лампы | Гро-Люкс | 69 | |
| Мультитронный фотобиореактор HT | Инфомеры |
Теги
