Saponin-проницаемыми волокна подготовки в сочетании с respirometric окислительного фосфорилирования обеспечивает анализ интегративной оценки митохондриальной функции. Митохондриальная дыхания в физиологических и патологических состояний могут отражать различные регуляторных влияний в том числе митохондриальных взаимодействий, морфологии и биохимии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Respirometric окислительного фосфорилирования в оценке Saponin-проницаемыми Сердечные волокна
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Исследование функции митохондрий, представляет собой важный параметр сердечной физиологии митохондрий принимают участие в энергетическом обмене, окислительный стресс, апоптоз, старение, митохондриальная encephalomyopathies и токсичности препаратов. Учитывая это, технологий для измерения сердечной функции митохондрий, пользуются спросом. Один из методов, который использует комплексный подход для оценки митохондриальной функции respirometric окислительного фосфорилирования (OXPHOS) анализа.
Принцип оценки respirometric OXPHOS сосредоточена вокруг измерения концентрации кислорода использованием электрода Кларка. Как проницаемыми расслоение потребляет кислород, концентрация кислорода в закрытой камере снижается. Использование выбранный субстрат-ингибитор-разобщающий агент протоколов титрования, электроны предоставляются участки, специально предназначенные электрон-транспортной цепи, позволяющие оценки митохондриальной функции. До respirometric анализ митохондриальной функции, механические и химические методы подготовительных используются для permeabilize сарколеммы мышечных волокон. Химическая пермеабилизации работают сапонин выборочно перфорировать мембраны клетки, сохраняя при этом сотовая архитектура.
Эта статья полностью описывает шаги, связанные с подготовкой сапонин кожей сердечных волокон для измерения потребления кислорода для оценки митохондриальной OXPHOS. Кроме того, устранение неполадок консультации, а также специфических субстратов, ингибиторов и разобщители, которые могут быть использованы для определения функции митохондрий в определенных участков электрон-транспортной цепи предоставляются. Важно отметить, что описанный протокол может быть легко применить к сердечной и скелетной ткани различных моделей животных и человека образцов.
Протокол
1. Подготовка реагентов
- Релаксации и сохранение решение (RP решения) получают, как описано выше, с незначительными изменениями 1. Короче говоря, решение RP состоит из 2.77mM CAK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20 мМ имидазол, 0,5 мм дитиотреитол, 20мм таурин, 50 мМ К-MES, 6,56 MgCl 2, 5.7 мм АТФ, фосфокреатина 14.3mM, рН 7,1, с поправкой при комнатной температуре (RT). Фильтр решение через 0,45-мкм фильтр для стерилизации. Разделите на 15 мл порциями (Falcon полипропиленовые трубы) и хранят при температуре -20 ° C См. обсуждение по рецептам.
- Митохондриальная Решение Respirometry (MiR05) получают, как описано в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сапонин-проницаемыми сердечной техника волокна предлагает уникальный компромисс между в пробирке и в естественных оценки митохондриальной потребления кислорода OXPHOS. Преимущества этого метода включают повышенную физиологическую значимость по сравнению с изолированными митохондриями, как сотовые архитектуры сохраняется. В то время как плазматическая мембрана разрушается, внутриклеточных мембранных структур митохондрий в том числе 12, 14, саркоплазматического ретикулума 14, myofil.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения и Геном Канада. JS имеет зарплату поддержки награды от Альберта Heritage Foundation медицинских исследований сердца и инсульта фонда Канады и Канадской Ассоциации Диабета. Лаборатория хотел бы выразить признательность технической помощи инструментов Oroboros при приобретении сапонин-проницаемыми волокна техники.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 100% этанол | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% этанол | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Аденозин 5-фосфат′дигидрат монопотассиевой соли дифосфата (АДФ) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Альбумин сыворотки быка, практически свободный от жирных кислот–бесплатно | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Антимицин А | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Аскорбиновая кислота | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Аденозин 5′гидрат натриевой соли аденозинтрифосфата (АТФ) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Атрактилозид | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Карбонат кальция | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Карбонилцианид p-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Цитохром c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Дигитонин | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Дитиотреитол | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| этиленгликоль-бис(2-амино–тилефир)-N,N,N′,N′этиленгликоль-тетрауксусная кислота (ЭГТА) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Глутаминовая кислота | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Имидазол | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Кетамин | Pfizer Pharma GmbH | Кетасет | |
| Лактобиониковая кислота | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Хлорид магния (MgCl2)2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Гексагидрат хлорида магния (MgCl₂·6H₂O)2∙6 ч2О) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Яблочная кислота | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| МЭС (2-(N-морфолино)этансульфокислота) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’дигидрохлорид N,N,N',N'-тетраметил-p-фенилендиамина (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Олигомицин | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Фосфокреатин | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Хлорид калия | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Гидроксид калия | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Цианид калия | Fluka | 60178 | |
| Монокалийфосфат | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Ротеннон | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Сапонин | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Пентобарбитал натрия | Ceva Santé Animale | 1715 138 | Конц. 54,7 мг/мл |
| Пируват натрия | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Янтарная кислота | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Сахароза | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Таурин | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Ксилазин | Bayer AG | Rompun | |
| двойная дистиллированная вода2О | |||
| Лед | |||
| Оксиграф Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| салфетки Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 15 мл | VWR international | 89004-368 | |
| полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 50 мл | VWR international | 89004-364 | |
| Прямые ювелирные пинцеты | Джордж Тиманн &и компания | 160-50B | |
| Изогнутый ювелирный пинцет | Джордж Тиманн &и компания | 160-57B | |
| Прямые хирургические ножницы | Джордж Тиманн &и Ко. | 105-402 | |
| Стерильный хирургический скальпель | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μШприцевые фильтры | VWR international | CA28145-485 | |
| pH-метр | VWR international | CA11388-308 | |
| Стеклянные чашки Петри | VWR international | 89000-300 | |
| 12-луночные полистирольные планшеты для культивирования тканей | VWR International | 82050-926 | |
| Магнитная мешалка | VWR international | 97042-594 | |
| Микромагнитные мешалки Fisherbrand | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Весы | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μмикрошприц Hamilton | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μмикрошприц Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μмикрошприц Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Сжимаемые бутыли Nalgene | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Полистироловые чашки для взвешивания | VWR international | 89106-750 | |
| Стереомикроскоп | Olympus Corporation |
Ссылки
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , S....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
