Моделирование фагоцитоза, опосредованного комплементом, с использованием опсонизированных эритроцитов in vitro

Аннотация

Источник: Nagre, N. и др. Фагоцитоз альвеолярных макрофагов и очищение бактерий у мышей. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется оценка фагоцитоза, опосредованного рецептором комплемента, с использованием овечьих эритроцитов, опсонизированных с IgM и комплементом, а затем их поглощение макрофагами мышей. Степень фагоцитоза количественно определяется путем измерения синего хромогенного продукта, образованного в результате окисления диаминофторена, катализируемого гемоглобином.

Протокол

1. Фагоцитоз, опосредованный FcγR и CR

1. Для опсонизации инкубируют 2 x 10⁸ овец эритроцитов (SRBC) с 50 мкл кроличьего анти-SRBC-IgM или 50 мкл кроличьих анти-SRBC-IgG в течение 30 минут при комнатной температуре.
2. Инкубировать IgM-опсонизированные SRBC с 50 мкл человеческой сыворотки с дефицитом C5 (C5D) в течение 30 минут при 37 °C для фиксации фрагментов комплемента C3b и C3bi на IgM-покрытых SRBC.
3. Клетки макрофага мышиных мышей (MH-S клетки) (10 000 клеток на колодцу) в пластине на 96 лунок и инкубируют за ночь, чтобы получить ~70% слияния. Добавьте 100 мкл 1 x 10 опсонизированных SRBC с концентрацией^7/мл в каждую скважину клеток MH-S и инкубировать 1 час при 37 °C. Несвязанные SRBC очень быстро (~1 мин) промыть 100 мкл буфера лизиса хлорида аммония и калия (ACK).
4. Лизируйте клетки с помощью 0,1% SDS и добавьте 50 мкл 2,7-диаминофлуорена (DAF), содержащего 3% перекиси водорода и 6 млн мочевины. Измерьте поглощение флуореновой синей, катализируемой гемоглобином, на расстоянии 620 нм.
5. Определите количество SRBC, используя стандартную кривую при значениях поглощения 620 нм с известным количеством SRBC. Аналогично, процессные MH-S-клетки, инкубированные с неопсонизированными SRBC, используются в качестве отрицательных контролей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2,7-диаминофлуорен (DAF)	Сигма-Олдрич	D17106	Степень молекулярной биологии
70% этанол	Decon Labs Inc.	18C27B	Аналитическая категория
96-колодцевая пластина	Корнинг	3603	Класс клеточной биологии
Буфер лизиса ACK	Жизненные технологии	A10492	Степень молекулярной биологии
Сыворотка с дефицитом C5	Сигма-Олдрич	C1163	Биохимический реагент
Центрифуга	Labnet International	C0160-R
Цитоцентрифуга Cytospin 4	Thermofisher Scientific	A78300101 Выпуск 11
Среда для культуры клеток DMEM	Gibco	11995-065	Класс клеточной биологии
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Класс клеточной биологии
Потоковый цитометр	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Щипцы	Дюмон	0508-SS/45-PS-1	Подходит для вскрытия лабораторных животных
Стеклянная чаша	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Класс клеточной биологии
Шприц высокого давления	Penn-Century	FMJ-250	Подходит для использования в лабораторных животных
Гомогенизатор	Omni International	TH-01
Перекись водорода	Сигма-Олдрич	H1009	Аналитическая категория
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Олимп	IX73
Аэрозолизатор MicroSprayer	Penn-Century	IA-1C	Подходит для использования в лабораторных животных
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	P6148	Класс реагента
PBS	Gibco	20012-027	Класс клеточной биологии
кролик против SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Подходит для иммуноанализов
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Подходит для иммуноанализов
Ножницы	Miltex	5-2	Подходит для вскрытия лабораторных животных
Эритроциты овец (SRBC)	MP Biomedicals	55876	Промытые, сохранившиеся SRBC