Визуализация локализации бактерий и взаимодействия хозяина в ткани лёгких человека

Abstract

Источник: Миллс, Б. и др., Оптический скрининг новых бактериоспецифических зондов на ткани легких человека экс виво с помощью конфокальной лазерной эндомикроскопии. J. Vis. Exp .(2017)

В этом видео демонстрируется изображение в реальном времени флуоресцентно меченого Staphylococcus aureus в суспензии и лёгких тканях с помощью фибрированной конфокальной флуоресцентной микроскопии.

Protocol

1. Сбор данных с помощью конфокальной лазерной эндомикроскопии (CLE)
   1. После настройки откроется окно для выбора места хранения и префикса файла. Выберите желаемую папку для хранения данных и назовите префикс соответственно.
   2. Разместите педали для ног так, чтобы оператор мог легко их использовать. Левая педаль: лазер включён/выключен; Центральная педаль: пауза; Правая педаль: запись/стоп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерные органы управления также доступны через экранные элементы.
   3. Нажмите «старт» на экране или нажмите педаль левой ноги, чтобы включить лазер. Это запускает получение и получение изображений с использованием 100% мощности лазера и частоты кадров 12 кадров в секунду (настройки по умолчанию).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для других задач эти настройки могут изменяться на экране при необходимости, в зависимости от типа образца.
   4. Сфотографируйте каждый образец бактериальной суспензии.
      1. Вставьте дистальный конец волокна FCFM (фибрированная конфокальная флуоресцентная микроскопия) и медленно проведите волокно по подвеске, чтобы исследовать образец.
      2. Записывайте видео любой длины (до 10 минут), нажимая педаль правой ноги или выбирая элементы записи на экране, пока волокно медленно движется вокруг сэмпла.
      3. Очистите дистальный конец волокна FCFM с помощью 8% H_2O2и очистите ткани для хруста между образцами. ​
         ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные видеодлины 10-30 с достаточны для in vitro визуализации.
   5. Сфотографируйте каждый образец легкой ткани.
      1. Введите дистальный конец волокна FCFM в образец, обеспечивая прямой контакт между концом волокна и тканью. Аккуратно поместите конец волокна для осмотра образца.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Подъём конца волокна от ткани удаляет ткань из фокальной плоскости; однако это может использоваться для изображения помеченных бактерий, которые не прилипли к ткани.
      2. Записывайте видео любой длины (до 10 минут), нажимая педаль правой ноги или выбирая элементы записи на экране, пока волокно медленно движется вокруг сэмпла.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для экс-виво съёмки тканей достаточно видео длиной 30 с.
      3. Очистите дистальный конец волокна FCFM с помощью салфеток для чистки линз и 8% H_2O2 между образцами.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-14 Микрофудж	SciQuip	90616	Небольшая настольная микроцентрифуга
96-колодцевая пластина	Корнинг	3370	Пробирная пластина
Calcein AM	Сигма Олдрич	17783	Коммерческий флуоресцентный краситель
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Конфокальное лазерное эндомикроскопическое устройство
Cletop-S	Клетоп	14110601	Очиститель волокон
Эппендорф (1,5 мл)	Эппендорф	30120086	Микрофужная трубка объемом 1,5 мл
Gibco Phosphate Buffered Физиологический раствор	Термо Фишер Сайентифик	10010023	PBS — промывочный материал
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Программное обеспечение для сбора и обработки данных для исследовательской системы CellVizio 488 нм
Нестандартные исследования AlveoFlex 488 нм	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Волокно конфокальной флуоресцентной микроскопии
Комплект Quanti 488 нм	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Калибровочный комплект для системы CellVizio 488
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Бактериальный штамм, использованный в этом исследовании
Полумикроспектрофотометрическая кюветка	Сигма Олдрич	C5416-100EA	Для спектрофотометрии
Термомиксер комфорт	Эппендорф	41102422	Настольный обогреватель с встряхиванием