Селективная очистка глистов при кенорхабдите с целью обогащения кишечной микробиоты

Аннотация

Источник: Morgan, E. и др. Селективная очистка нематод дикой кенорхабдита для обогащения бактерий кишечного микробиома. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео демонстрируется протокол выделения интересных кишечных бактерий от диких червей Caenorhabditis . Сначала червей морят голодом и промывают, чтобы устранить остаточные бактерии, питающиеся с их поверхности и просвета кишечника, сохраняя при этом целевые микробы. После очистки поверхности и множества этапов ползания червей вскрывают для извлечения кишечника, содержащего интересующие бактерии, которые затем собирают и замораживают для хранения.

Протокол

1. Диссекция кишечника и ПЦР-идентификация микробных видов

1. Выращивать животных при 20 °C в течение 3-4 дней, чтобы они могли голодать и уменьшить количество бактерий OP50-1 (штамм Escherichia coli OP50-1). Добавьте 5 мл среды M9 в тарелку с голодными червями.

2. Используя стерильную стеклянную пипетку и лампочку, пипетка M9+ червячков из пластины и переместить их в стерильную центрифугную трубку ёмкостью 15 мл.

3. С помощью клинической центрифуги, прокрутите червей в трубке при 1000 x g в течение 30 секунд при комнатной температуре.

4. Используя стерильную пипетку на 15 мл, выньте супернатант из трубки центрифуга, не беспокоя живых червей на дне трубки.

5. Добавьте 10 мл M9 + 0,05% Triton X-100 и инкубировать трубку на нутаторе в течение 20 минут для удаления внешних микробов. Повторите четыре раза, чтобы промыть червей.

6. После последней промывки, используя стерильный наконечник пипетки, удалите супернатант, не трогая гранулу внизу, в 100 мкл раствора.

7. Используя стерильный наконечник пипетки, перенесите M9 и червей на незасеянную пластину NGM и дайте пластине высохнуть, пока черви ползут 20 минут, чтобы помочь удалить OP50-1 из кутикулы и кишечника.

8. Добавьте 250 мкл M9 на высушенную пластину и используйте стеклянную пипетку для пересадки M9 + червей на новую незасеянную пластину NGM. Опять же, дайте тарелке высохнуть и дайте червям ползти по ней 20 минут.

9. Добавьте 250 мкл M9 на пластину и перенесите 100 мкл M9 + червей в чистое стекло часов.

10. Используя две стерильные иглы для шприца по 26 G, обезглавите нематоды, удерживая червя одной иглой, а другой — для разрезания червя. После обезглавливания кишечник (гранулированный) и гонада (прозрачная) из тела естественным образом выходят из организма.

11. Отрежьте кусочек открытого кишечника, удерживая кишечник одной иглой, а другой разрезав её.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, убедитесь, что интересующий микроб всё ещё присутствует в эвертированных кишечниках с помощью микроскопии Нормарского, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) или иммуногистохимии.

12. Переместить один расчлененный кишечник в ПЦР-пробирку объемом 0,5 мл с 10 мкл стерильной воды. Повторяйте в общей сложности не менее 5 трубок ПЦР (полимеразной цепной реакции), содержащих кишечник разных животных.

13. Заморозьте ПЦР-трубки при -80 °C минимум на 5 минут. Достаньте ПЦР-пробирки из морозильника и разморозьте образцы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агарозе	Fisher Scientific	BP1356
10% SDS	Инвитроген	AM9822
Игла BD PrecisionGlide — 26 G	Fisher Scientific	305115
KH₂PO₄	Fisher Scientific	P-286
NaCl	Fisher Scientific	S-671
NH₄Cl	Fisher Scientific	A-661
Стрептомицин	Миллипор-Сигма	S6501-50G
Тетрациклин	Миллипор-Сигма	T7660-5G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP-151
Очки для часов	VWR	470144-850