Флуоресценция in situ гибридизация кишечных бактерий в срезах кишечника мышей

Аннотация

Источник: Ng, K. M., Tropini, C. Визуализация взаимодействий микробиоты кишечника с хозяином посредством флуоресценции in situ гибридизации, окрашивания лектина и визуализации. J. Vis. Exp . (2021).

В этом видео демонстрируется процедура флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для окрашивания микробиоты кишечника в тканях кишечника мышей путём гибридизации флуоресцентных зондов с бактериальной рРНК (рибосомной рибонуклеиновой кислоты) и контрокрашивания структур хозяина для микроскопического анализа.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных

1. Бактериальное окрашивание с помощью FISH (флуоресцентная гибридизация in situ)
   1. Используйте блокатор жидкости или PAP-ручку (гидрофобное барьерное перо), чтобы ограничить площадь расширения жидкости, обводя область каждого среза ткани. Убедитесь, что чернила не соприкасаются с самим разделом. Создайте круг как можно ближе к каждому срезу ткани, не соприкасаясь с тканью, чтобы минимизировать площадь поверхности, которую необходимо покрыть раствором гибридизации.
   2. Подготовьте раствор для гибридизации: на каждые 50 мкл предварительно нагретого раствора для гибридизации добавляйте 0,5 мкг зонда (например, 0,5 мкл 1 мкг/мкл зонда). Пипетировать гибридизацию на секции затвора (~20 мкл/сечение, в зависимости от размера сечения/круга). С этого момента защищайте раствор для гибридизации и стекли от света во время этапов инкубации и хранения.
   3. Убедитесь, что объём жидкости покрывает всю секцию при наложении на гибкий пластиковый накладок. Инкубировать затвор в влажной камере, чтобы уменьшить испарение. Создайте влажную камеру с коробкой для пипеток с салфетками или бумажными полотенцами внизу, которые были пропитаны избытком раствора гибридизации или фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для повышения влажности. Инкубировать секции при 45-50 °C, в зависимости от установки зонда, в течение >3 часа.
   4. Прогрейте буфер для мытья FISH: 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4; В инкубационный период от 0,9 M NaCl до 50 °C. Подготовьте достаточно буфера для стирки, чтобы покрыть слайды в банке Coplin.
   5. Снимите пластиковые чехлы; Инкубировать слайды в буфере для мытья FISH в банке Coplin, обе предварительно прогреты до 50°C. Поставьте банку обратно в духовку при 50°C на 10-20 минут. Для толстых образцов удалите накладки из банки Coplin, добавив буфер и аккуратно сдвинув накладки, чтобы не размазать лом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Банка Коплина	Фишер	08-813E
Стекло на крышке, 22 × 22 мм, нет #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Сигма-Олдрич	D9542	Восстановили дозу до 5 мг/мл
Пустой ящик для наконечников пипетки			Чтобы расплавить парафин
Зонды FISH
Решение для гибридизации FISH	--	--	pH 20 мМ Tris–HCl 7,4, 0,9 млн NaCl, 0,01% (с в/в) SDS в воде без нуклеазы. Опциональное добавление формамида 5–50% (v/v)
Буфер для мытья рыб	--	--	pH 20 мМ Tris–HCl 7,4, 0,9 млн NaCl
Флуоресцентно маркированный лектин Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1)	Vector Laboratories	FL-1061 (с меткой флуоресцеина) или RL-1062-2 (с меткой родамина)	UEA-1 маркирует фукозилированные гликаны, поэтому он не подходит для мышей без микробов или для образцов хозяев с дефицитом фукозилтрансферазы 2 (FUT2).
Щипцы
Гибкие пластиковые накладки HybriSlip, 22 x 22 мм × 0,25 мм	Сигма Олдрич	GBL722222	для этапов гибридизации FISH можно заменить стеклянные покрытия
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Кимвайпс
Многофункциональные контейнеры для хранения образцов, 473 мл	Фишер	14-955-117A	Можно заменить на стеклянную или полиэтиленовую ёмкость по своему выбору. Метакарн несовместим с полистиролом или металлом.
Лак для ногтей	Науки об электронной микроскопии	72180	Любой лак для ногтей должен подойти
Духовка			Необходимый диапазон: 45-60 °C
PBS, фосфатно-буферный физиологический раствор (раствор 10x)	Фишер	BP3991	Разведите до 1x для протокола
Хлорид натрия	Фишер	S271
Раствор гидрохлорида Тризмы, 1M Tris-HCl, pH 7,4	Сигма-Олдрич	T2663-1L
Вода, без нуклеаз	Фишер	BP2484100