Ультрацентрифугированная изоляция наружных мембранных пузырьков Legionella pneumophila

Аннотация

Источник: Юнг, А. Л. и др. Наружные мембранные пузырьки Legionella pneumophila: выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео демонстрируется выделение внешних мембранных пузырьков (ОМВ) из Legionella pneumophila с помощью последовательной центрифугирования, стерильной фильтрации и ультрацентрифугирования. Очищенные ОМВ, обогащённые мембранными белками и липополисахаридами, подходят для исследований взаимодействия хозяина и патогена.

Протокол

1. Культивировать легионеллу пневмофилу

1. Нанесите штамм L. pneumophila Corby (дикий тип, WT) на агарные пластины с буферным угольным дрожжевым экстрактом (BCYE) и инкубировать их при 37 °C в течение 3 дней. Инокуляция 10 мл бульона с экстрактом дрожжей (YEB) при_{OD 600} 0,3 L . pneumophila из докультивной пластины; Инкубировать бактерии при 37 °C на вращающейся шейкере (150 об/мин) в течение 6 часов.
2. Проверьте чистоту жидкой культуры, распределив 100 мкл суспензии на кровяную агарную пластину. Инкубировать ночь при 37 °C.
3. Оставшуюся жидкую культуру добавьте в 90 мл свежей среды YEB и инкубируйте на вращающейся шейкере (37 °C и 150 об/мин), чтобы получить_{OD 600} на уровне 3,0-3,5, что занимает примерно 16-20 часов.

2. Подготовьте и количественно оцените наружные мембранные пузырьки L. pneumophila (OMV)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие этапы центрифугирования в стерильных условиях и при 4 °C.

1. Центрифугуйте жидкую культуру в концентрации 4000 г в течение 20 минут, чтобы пеллетировать бактерии. Перенесите супернатант в свежие центрифугные трубки, сбросьте бактериальную гранулу и повторите центрифугирование (4 000 x g в течение 20 минут). Повторите этот шаг один раз.
2. Стерильно фильтруйте оставшуюся поверхностную форму дважды (размер пор: 0,22 мкм). Переместить супернатант без бактерий в ультрацентрифугные трубки и провести ультрацентрифугу при 100 000 x g в течение 3 часа.
3. Декантируйте супернатант и выбросьте его. Суспензировать гранулу OMV в стерильном фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS) и ультрацентрифуге (100 000 x g на 3 часа) для удаления загрязняющих белков и LPS.
4. Отбросьте супернатант и снова подвесьте OMV-гранулу в 500 мкл стерильного PBS. Полоса 20 мкл на пластине кровяного агара и на пластине BCYE агара, чтобы исключить бактериальное загрязнение подготовленных пузырьков. Инкубировать пластину кровяного агара на ночь и пластину BCYE агарную пластину в течение 3 дней (оба при 37 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация 100 мл культуры L. pneumophila обычно составляет 1 мкг/мкл. Храните подготовленные и количественно измеренные OMV при -20 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашка Петри диаметром 10 см	Sarstedt AG & Co KG (Нуэмбрехт, Германия)	82.1473
Ротор 70 Ti	Корпорация Beckman Coulter (Калифорния, США)	337922
Кюветты	Sarstedt AG & Co KG (Нуэмбрехт, Германия)	67.742
Инкубатор Heracell 240i CO₂	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Брауншвейг, Германия)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Брауншвейг, Германия)	75004515
Инокуляционная петля	Sarstedt AG & Co KG (Нуэмбрехт, Германия)	86.1567.010
L. pneumophila Корби	---	---
PBS	Biochrom GmbH (Берлин, Германия)	L 1825
Вращающийся шейкер (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Брауншвейг, Германия)	SHKE6000
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Кембридж, Англия)	80-2116-30
Стерильный фильтр (размер пор: 0,22 мкм)	Корнинг Инкорпорейтед (Нью-Йорк, США)	431096
Активированный древесный уголь	Carl Roth GmbH & Co KG (Карлсруэ, Германия)	X865.2
Агар-агар, Кобе I	Carl Roth GmbH & Co KG (Карлсруэ, Германия)	5210.2
Колумбийский агар с 5% овечьей крови	Becton Dickinson GmbH (Гейдельберг, Германия)	254005
Экстракт дрожжей	Carl Roth GmbH & Co KG (Карлсруэ, Германия)	2363.2