Выделение и культивирование бактерий, связанных с Caenorhabditis elegans

Аннотация

Источник: Петерсен, К. и др., Выделение и характеристика естественной микробиоты модельного нематода Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp . (2022)

В этом видео демонстрируется выделение и культивирование бактериальных видов, связанных с Caenorhabditis elegans. Лизис C . elegans на основе бусин, а затем селективное культивирование позволяет выделить различные микробные штамы для дальнейшего анализа.

Протокол

1. Выделение и культивирование бактерий, связанных с нематодами (рисунок 1)

1. Для выделения бактерий подготовьте пластину на 96 лунок с тремя стерильными шариками диаметром 1 мм, 20 мкл буфера M9 с минимальным содержанием средних солей (M9) на каждую скважину и пипеткой по отдельной, промытой нематоде в каждую скважину, переливая как можно меньше жидкости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, популяции червей можно промыть с пластин с помощью M9-буфера, а ~300 мкл червячносодержащего M9-буфера можно перенести в трубки объемом 2 мл с 10-15 шариками.
2. Разбивайте нематод с помощью гомогенизатора бусинок (например, взбивание шариками в течение 3 минут при 30 Гц). Кратковременно центрифугуйте пластину или трубки, чтобы жидкость опустилась на дно (например, 10 секунд при 8000 x g при комнатной температуре, RT).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование этого метода привело к выделению бактериальных таксонов, аналогичных тем, выявленных при секвенировании ампликонов 16S рибосомной ДНК (рДНК), что свидетельствует о том, что описанное биение шариками оставляет большинство бактериальных клеток целыми.
3. Соберите супернатант, последовательно разбавьте его в частоте 1:10 и разложите до 100 мкл на агарные пластины диаметром 9 см.
   1. Чтобы обеспечить выращивание большинства бактерий, используйте различные альтернативные среды с разным составом питательных веществ, включая разбавленный соевый агар триптиказы (TSA, разбавление 1:10), агар-мак МакКонки, сахарный агар Сабуро, картофельный декстроза агар или дрожжевый пептонный декстрозовый агар.
4. Инкубировать пластины при средних температурах места отбора проб (например, температура от 15 до 20 °C для умеренных регионов) в течение 24-48 часов.
5. Используйте стандартную трёхполосную технику и стерильную петлю для получения чистых бактериальных культур (рисунок 1).
   1. Выберите одну колонию с пластины с помощью стерильной петли или зубочистки и протяните её на новую агарную пластину с той же средой агар, что используется для очистки. Обязательно используй примерно треть пластины.
   2. Либо используйте новую стерильную петлю, либо простерилизуйте многоразовую петлю и проведите её через первую полосу, чтобы создать вторую полосу на ещё одной трети той же пластины.
   3. Повторите этот шаг, протягивая стерильную петлю через вторую полосу.
   4. Инкубировать пластину в тех же условиях роста, что и для изоляции. Эта техника должна привести к росту отдельных колоний в зоне третьей полосы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется повторять этап очистки несколько раз, так как натуральные изоляты склонны образовывать биопленки и/или агрегаты.
6. Выращивайте чистые колонии в жидкой среде (того же типа, что и агарная), используя ту же температуру и время роста, что и выше (шаг 1.4).

Результаты

Рисунок 1: Идентификация видов и выделение отдельных бактерий. Отдельные нематоды расщепляются с помощью гомогенизатора бусин, а ДНК выделяется для определения видов с помощью ПЦР или секвенирования. В качестве альтернативы раздробленный материал...