$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Внутриклеточная бактериальная изоляция (IBC): пипетирование IBC через рот
ПРИМЕЧАНИЕ: Все методы, описанные в этом разделе, прошли институциональную оценку рисков. Ротовая пипетка несёт в себе внутренний риск проглатывания раствора, который передаётся. Этот риск в значительной степени уменьшается благодаря нанолитровым объёмам, используемым этим протоколом, и мы рекомендуем всем пользователям протокола обращать внимание на предупреждения и практические заметки, приведённые здесь и в обсуждении.
- После того как клетки будут соскребаны в PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор), установите аппарат для микропипетации рта (рисунок 1C).
- Вставьте более толстый конец вытянутого стеклянного капилляра (не натянутый) в резиновую пробку (белый конец) трубки аспиратора.
- Вставьте узкий конец наконечника пипетки объёмом 1 мл в другой открытый (красный) конец трубки аспиратора, обеспечив плотное прилегание.
- Вставьте узкий конец атмосферной пипетки объёмом 2 мл в открытый, широкий конец наконечника пипетки объёмом 1 мл, снова обеспечив плотное прилегание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученная система позволяет исследователю делать пипетку ротом с широкого, открытого конца аспирирующей пипетки, создавая мягкую силу всасывания с узкого конца капиллярной трубки на другом конце аппарата. - Проверьте финальный аппарат для микропипетирования с использованием чашки Петри диаметром 100 мм, содержащей свежую деионизированную воду. Лёгкое всасывание на открытом конце аспирирующей пипетки (подобно напитку через трубочку) должно увеличить уровень жидкости в капилляре, но не привести к переполнению деионизированной воды в трубку аспиратора. Одной рукой управляйте капиллярной трубкой, а другой — для регулировки положения чашки Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сила всасывания, необходимая для ротовой пипки одного IBC, будет различаться у разных исследователей. Однако рекомендуется каждому исследователю, использующему эту технику, начинать с слабого всасывания и постепенно увеличивать его, если жидкость не течёт по капилляру. Нет нужды в силе больше, чем сосать трубочку для пьянства. Если капилляр не впитывает жидкость во время теста в шаге 1.1.4, возможно, что капилляр или аспирационная трубка заблокированы и требуют замены. Кроме того, рекомендуется всем новым исследователям сначала практиковать контроль всасывания во рту с помощью стерилизированной воды. Кроме того, обратите внимание, что управление объёмом, поглощённым аппаратом для ротовой пипетки, осуществляется с помощью языка исследователя. Язык может тонко регулировать силу всасывания, а также выполнять функции экстренной остановки. - После успешного поглощения жидкости проверьте способность её вывести из капилляра, аккуратно подув в открытый конец аспирационной пипетки. Убедитесь, что при выведении жидкости не образуются пузырьки, чтобы предотвратить загрязнение IBC на этапе 1.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как и при всасывании, сила положительного давления, приложенного исследователем для выброса IBC в центрифугную трубку, будет различаться у разных исследователей. Исследователям, новичкам в этом протоколе, рекомендуется выполнять шаг 1.1 за несколько дней до самого заражения. Один из советов для практики микропипетки через рот — практиковать перемещение небольших объёмов стерилизированной воды, смешанной с несколькими каплями пищевого красителя (для видимости) с помощью микропипетки для рта.
- Поместите суспензированную суспензию клетки под расщепляющий микроскоп и идентифицируйте IBC как крупные флуоресцентные агрегаты (рисунок 1A, B). Идеальный диапазон увеличения — 20-40x. Окуньте тонкий конец стеклянного капилляра в свежую трубку PBS на 1 секунду, чтобы уменьшить поглощение нежелательного объёма за счёт капиллярного действия.
- Посмотрев в микроскоп, определите интересующий IBC и медленно подведите открытый конец капиллярной трубки к IBC. Используйте тонкий конец стеклянного капилляра, чтобы убрать дополнительные клетки возле каждого IBC, чтобы предотвратить аспирацию двух или более клеток или разбить крупные скопления клеток.
- Во время просмотра через микроскоп приложите очень малую всасивающую силу на дальний конец (аспирирующую пипетку) ротового микропипетирующего аппарата, чтобы направить IBC в стеклянный капилляр.
- После подбора IBC переместите капилляр в пустую трубку центрифугы объёмом 1,5 мл и приложите небольшое положительное давление, чтобы вытеснить каплю и IBC в центрифугу (рисунок 1D).
- Повторите шаги 1.3-1.6 на столько, сколько IBC требуется от текущего мочевого пузыря, прежде чем перейти к следующему мочевому пузыре. Часто меняйте аспирирующие пипетки и капилляры, чтобы предотвратить скопление слюны.
ВНИМАНИЕ: При работе с инфекционными (или клиническими) штаммами бактерий постоянно следите за уровнем раствора в капиллярах. Не позволяйте уровню жидкости, набираемой в пипет, переливаться с края капилляра в трубку аспиратора. Если это случится, немедленно переключитесь на другую аспираторную трубку и откажитесь от предыдущей настройки. - Повторяйте шаги 1.2–1.6 на всех собранных мочевых пузырях или пока не будет собрано достаточное количество биологических образцов для экспериментальной группы.
- (По желанию) Повторяйте шаги 1.6 и 1.7, пока все экспериментальные группы (или мыши) не будут эвтаназии и не будут собраны достаточные биологические образцы из каждой группы.
