Обнаружение экспрессии целевых генов в мозге мышей, инфицированного бактериями

Аннотация

Источник: Zhang, S. , и др. Внутричерепный субарахноидальный путь инфекции для изучения роли биопленок Streptococcus suis при менингите в модели инфекции мышей. J. Vis. Exp . (2018).

Это видео демонстрирует обнаружение экспрессии целевых генов в мозге мыши, инфицированного бактериями. РНК извлекается, обрабатывается ферментом, разлагающим ДНК, и обратно транскрибируется в кДНК. cДНК амплифицируется через термический цикл с геноспецифическими праймерами, в то время как краситель, связывающий ДНК, связывается с амплифицированной ДНК, излучая флуоресценцию. Флуоресцентные сигналы анализируются для подтверждения наличия целевого гена.

Протокол

1. Подготовка бактерий

Примечание: Вирулентный штамм Streptococcus suis (S. suis) серотипа 2 P1/7 был выделен у больной свиньи с менингитом. Штамм P1/7 был выращён в бульоне Тодда-Хьюитта (THB, формула на литр THB: инфузия в сердце, 3,1 г; неопептон, 20,0 г; декстроза, 2,0 г; хлорид натрия, 2,0 г; динатрийфосфат, 0,4 г; карбонат натрия, 2,5 г) и покрыт на агаре Тодда-Хьюитта (THA, формула на литр THA: инфузия в сердце, 3,1 г; неопептон, 20,0 г; декстроза, 2,0 г; хлорид натрия, 2,0 г; динатрийфосфат — 0,4 г; карбонат натрия — 2,5 г; агар, 15,0 г) при 37 °C и 5%_CO2.

1. Коллекция планктонных клеток штама P1/7
   1. Соберите 5 мл планктонных клеток из культуры среднелогаморфной фазы (_{OD 600}=0,6), центрифугайте 3 минуты при 8000 × г, затем промывайте 3 раза с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
   2. Суспензируйте клетки с 5 мл 25% глицерила в ТГБ, аликвот в 5 пробирках и храните при -80 °C.
2. Коллекция клеток состояния биопленки штама P1/7
   1. Возьмите 20 мл ночной культуры и добавьте к 180 мл свежего THB; Разбавленную культуру разделите поровну на 10 круглых тарелок и затем поместите их в инкубатор при 37 °C при 5%_CO2 на 24 часа.
   2. После инкубации аккуратно встряхните пластину, чтобы суспензировать бактерии, не прилипшие к пластине, а затем выбросьте супернатант аспирацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно потрясите пластину и избегайте повторного взвешивания осадка.
   3. Добавьте 5 мл PBS для получения клеток состояния биопленки, полностью суспензируйте осадок и затем перенесите образец в новую пробирку.
   4. Сониковать клетки состояния биопленки с последнего шага с помощью следующих параметров: 60 Вт, 4 цикла, 5 с включением и 10 секунд выключения.
   5. Центрифугуйте 3 минуты при 8000 × г и храните супернатант при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант может содержать компоненты биопленки и может использоваться для повторной суспензии бактерий биопленки перед заражением, как описано в экспериментах на животных (Шаг 2).
   6. Суспензировать осадок с 10 мл 25% глицерина в THB, а затем хранить клетки биопленки при -80 °C.

2. Эксперименты на животных

1. Используйте SPF 6-недельных самок мышей BALB/C в этом исследовании. Инфицировать всех мышей через внутричерепный субарахноидальный путь инфекции, место инъекции которого находится в 3,5 мм ростраль от брегмы.
   1. Для гистопатологического анализа инфицируйте две группы мышей (по 5 мышей в группе) с помощью планктонных клеток или клеток биопленки в дозе 3 × 10 7 единиц^{формирования} колоний (CFU), а ещё 5 мышей вводят PBS в качестве контроля.
   2. Для обнаружения экспрессии мРНК TLR2 и цитокинов в мозге инфицируйте две дополнительные группы мышей (по 6 мышей в группе) с помощью планктонных клеток или биопленочных клеток при дозе 3 × 10⁷ CFU.
   3. Определите количество жизнеспособных бактерий путём нанесения серийных разбавлений на THA.
   4. Эвтаназия всех мышей через 12 часов после заражения для дальнейших исследований. ​
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глицерин из стандартной среды необходимо удалить до заражения. И планктонные клетки, и клетки биопленки, полученные при -80 °C, промываются три раза с помощью PBS. Затем планктонные клетки суспензируются с помощью PBS и разбавляются до соответствующей дозы для инфекции; Клетки состояния биопленки ресуспендируются вместе с накопленным супернатантом (начиная с шага 1.2.5) и разбавляются до соответствующей дозы для инфекции. Объём инфекции не должен превышать 50 мкл.
2. Обнаружение экспрессии мРНК TLR2 и цитокинов в ткани мозга
   1. Извлечете всю РНК из ткани мозга с помощью набора для экстракции РНК.
      1. Для каждой мыши используйте всю ткань мозга для извлечения РНК. Разделите всю ткань мозга на 5 трубок. Возьмите до 100 мг мозговой ткани и добавьте 1 мл раствора лизиса в каждую трубку, содержащую лизирующую матрицу, предоставленную набором.
      2. Обработайте трубку в гомогенизаторе 40 секунд при температуре 6,0, затем центрифугайте при 12000 × г и 4 °C в течение 5 минут.
      3. После центрифугирования перенесите верхнюю фазу в новую микроцентрифугальную трубку.
      4. Инкубировать перенесённый образец в течение 5 минут при комнатной температуре; Добавьте 300 мкл хлороформа, вихрьте 10 секунд, затем инкубируют 5 минут при комнатной температуре.
      5. Центрифугуйте трубку при 12000 × г и 4 °C в течение 5 минут. Перенесите верхнюю фазу на новую трубку.
      6. Добавьте в трубку 500 мкл холодного абсолютного этанола, затем инвертируйте её 5 раз, а затем храните образец при -20 °C не менее 1 часа.
      7. Центрифугуйте трубку при 12000 × г и 4 °C на 15 минут и удалите супернатант. Промой гранулы 500 мкл холодного этанола 75% в воде без РНазы (_{H 20}).
      8. Удалите этанол, высушите гранулу на воздухе 5 минут при комнатной температуре и снова суспензуйте РНК в 100 мкл безрназного_{H 2}O.
      9. Инкубировать РНК в течение 5 минут при комнатной температуре и определить концентрацию РНК с помощью биоанализатора РНК.
   2. Провести комплементарный синтез ДНК (cDNA), включая ликвидацию геномной ДНК (gDNA), с помощью термоциклера с набором реагентов для обратной транскрипции (RT).
      1. Добавьте 1 мкг РНК в пробирку, содержащую 2 мкл 5x буфера для элиминации гДНК, 1 мкл фермента для элиминации гДНК и свободного от РНазы_{H 2}O до достижения объёма 10 мкл. Инкубировать в течение 2 минут при 42 °C.
      2. Добавьте 10 мкл мастер-смеси (1 мкл фермента RT Mix I, 1 мкл RT праймерной смеси, 4 мкл 5x Buffer 2 и 4 мкл РНаз-свободного H₂O) в раствор реакции с последнего этапа и аккуратно перемешайте. Немедленно перейти к реакции RT: 37 °C в течение 15 минут и затем 85 °C в течение 5 секунд.
      3. Проведите количественный анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-qPCR) с помощью аппарата ПЦР в реальном времени с комплектом SYBR RT-qPCR. Добавьте 10 мкл 2x фермента, 0,8 мкл прямого праймера, 0,8 мкл обратного праймера, 0,4 мкл 50x ROX Reference Dye II, 2 мкл кДНК-шаблона и РНаз-свободного_H2Oдо общего объёма 20 мкл.
      4. Каждую пробу пропустите в тройном экземпляре с использованием следующих тепловых параметров: 30 с при 94 °C, затем 40 циклов по 5 с при 95 °C и 34 с при 60 °C, с финальной ступенью 15 с при 95 °C, 1 минута при 60 °C и 15 с при 95 °C. Праймеры для RT-qPCR приведены в таблице 1. В качестве внутреннего контроля использовались гены Housekeeping B2m и рРНК 18s .
   3. Вычислите относительное изменение складки на основе метода ^2-ΔΔCt .

Таблица 1: Праймеры для RT-qPCR.

Название буквы	Последовательность (5'-3')	Генный символ
IL-6 вперёд	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	IL6
Реверс IL-6	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	IL6
TLR2 вперёд	CACTATCCGGGGGTTGCATATC	Tlr2
Реверс TLR2	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC	Tlr2
Вперед CCL2	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
Обратная версия CCL2	ACTACAGCTTCTTTGGGACAC	Ccl2
Форвард TNF-α	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCTCT	TNF
Обратная сторона TNF-α	GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG	TNF
β2 м вперёд	GGTCTTTCTGGTGGTGTCT	B2m
Обратная сторона β2M	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2m
Форвард 18 секунд	GTAACCCGTTGAACCCCATT	рРНК 18-х
Реверс 18s	CCATCCAATCGGGGTAGTAGCG	рРНК 18-х

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бульон Тодда Хьюитта (THB)	Бектон, Дикинсон и компания	DF0492078	Растворите 30 г порошка в 1 л очищенной воды. Автоклав под углом 121° в течение 15 минут.
Агар	DSBIO	16C0050	Растворите 15 г порошка в 1 литре THB. Автоклав под углом 121° в течение 15 минут.
Эталонная система очистки воды Milli-Q	Merck KGaA	Z00QSVCUS	Без Dnase/Rnase
NaCl	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd	10019318
Na₂HPO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009012-01-09
KCl	Xilong Scientific Co., Ltd	9009017-01-09
KH₂PO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009019-01-09
KOH	Xilong Scientific Co., Ltd	9009014-01-09
Глицерин	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Разбавленное равным объёмом очищенной воды, автоклав под углом 121° в течение 15 минут
4% параформальдегид	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	80096675
25% глутаральдегид	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	30092436	В 10 раз разбавлены очищенной водой для фиксации.
Этанол	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218
Хлороформ	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10006818
Спектрофотометр	DeNovix Inc.	DS-11+
Дробилка для ультразвуковых клеток	NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd	JY96-IIN
Центрифуга	Hitachi Koki Co., Ltd	CT15RE
Холодильник	Aucma Co., Ltd	DW-86L500
Зелёный набор FastRNA Pro	MP Biomedicals	#6045-050
Инструмент FastPrep-24	MP Biomedicals	116005500
Инструмент для ПЦР	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Термо Фишер Сайентифик	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR820A
Набор реагентов PrimeScript RT с ластиком gDNA	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR047A