Аэрозольная доставка Mycobacterium tuberculosis при легочной инфекции в модели мыши

Аннотация

Источник: Мюллер, А. и др. Экспериментальная модель для изучения коинфекции туберкулёза и малярии при естественной передаче Mycobacterium tuberculosis и Plasmodium berghei. J. Vis. Exp . (2014)

В этом видео демонстрируется аэрозольная доставка Mycobacterium tuberculosis (Mtb ) мышам с помощью системы камер на основе небулайзера для индуцирования легочной инфекции, предоставляя контролируемую и воспроизводимую модель для изучения воздушно-капельной передачи туберкулёза и взаимодействия хозяина и патогена in vivo.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Аэрозольная инфекция мышей Mtb с использованием аэрозольной камеры Glas-Col

Лучший способ стандартизации аэрозольной инфекции экспериментальных животных Mtb (Mycobacterium tuberculosis) — использовать микобактерии из замороженных запасов с известными титрами КФУ (колониообразующих единицы). Для подготовки бульонских культур культивируют Mtb в бульоне Middlebrook 7H9, дополненном обогащающей средой OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза, каталаза) и 0,05% Tween 80, источником углерода для микобактерий, а также принимаются меры для предотвращения бактериального скупления. Культуры должны иметь оптическую плотность (OD) ≤ 1 на момент сбора урожая. При повышенном ОД бактериальное скопление увеличивается, а жизнеспособность снижается. Храните 1 мл аликвотов при -80 °C. Определите количество жизнеспособных ХФУ в замороженных запасах, покрывая серию 10-кратных разбавлений трёх независимых флаконов на агарных пластинах 7H11, дополненных 0,5% глицерила, 1 г/л аспарагина и OADC, а также перечисляйте колонии через 4 недели инкубации при 37 °C. Проведите аэрозольную инфекцию, как описано ниже.

1. Разморозьте Mtb известный титр CFU и аккуратно перемешайте суспензию пять раз для рассеивания бактериальных комков с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 27 G. Избегайте производства аэрозолей.
2. В зависимости от желаемой дозы инфекции необходимо перенести необходимый объём микобактериального запаса в пробирку объемом 50 мл с физиологическим раствором со стерильным фосфатом-буфером (PBS). Последний объём — 6 мл.

ПРИМЕЧАНИЕ: Изменяя количество микроорганизмов в этой суспензии, доля бактерий, содержащих капли аэрозолей, варьируется. Обычно мы стремимся к поглощению 100 жизнеспособных бацилл на лёгкое (низкодозовая инфекция). По нашему опыту, для этого требуется примерно 1-2 × 10⁶ млн тб/мл при общем объёме 6 мл, из которых 5,5 мл небулайзеруются. Рекомендуется провести серию экспериментальных аэрозольных испытаний с разными концентрациями бактерий, чтобы найти идеальные условия для вашей инфекции. В то время как инфекции с высокими дозами до 5 000 микобактерий можно провести для ускорения инфекционного процесса, для успешного заражения мышей аэрозолями можно использовать всего 5 бактерий. Частота заражения обычно составляет 100%.

3. Удалять достаточный объём (подготовленный выше конечного объёма) для нанесения посуды, чтобы определить титр инокуля; Обычно мы удаляем 500 мкл для технических тройных пластин.
4. Поместите животных в сетчатую корзину (по одной мыши на корзину) в круглой аэрозольной камере и закройте крышку аэрозольной камеры.

ПРИМЕЧАНИЕ: Другие модели оснащены корзиной в форме пирога, состоящей из пяти отдельных отделений, каждый из которых может вместить 20 мышей.

5. Подключите блок небулайзера Вентури к трём сочленениям нержавеющей стали.
6. Удалите микобактериальную суспензию из пробирки объёмом 50 мл с помощью шприца на 10 мл с иглой для тупой игли 18 г и перенесите шприц в аэрозольную камеру в закрытом транспортном ящике.
7. Снимите винтовую крышку небулайзера и аккуратно введите суспензию микобактерий в небулайзер. Избегайте образования аэрозолей. Выбросьте шприц в контейнер для острых предметов с 2% буратоном. Герметизируйте небулайзер крышкой винтов.
8. Включите главный выключатель питания и УФ-лампу. На экране на клавиатуре управления отображается надпись «Glas-Col Apparatus Co».
9. Включите программный выключатель. На экране появится сообщение «Готов ли небулайзер?» «Корзина загружена?» Нажмите Enter, когда готовы». Нажмите Enter.
10. На дисплее показано «Enter Time Preheat 900»; Это означает, что время предварительного нагрева для мусоросжигателя (который обезвреживает выхлопной воздух) составляет 900 секунд. Нажмите Enter.
11. На дисплее будет показано «Введение времени забулайзера 1 800»; Это означает, что время небулайзера по умолчанию установлено на 1 800 сек. Чтобы увеличить время небулайзера, введите «2,400» и нажмите Enter.

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время цикла небулайзера воздух под давлением атомизирует суспензию, образуя мелкие капли аэрозолей с микобактериями. При основном потоке воздуха эти капли размером примерно 2–5 мкм попадают в аэрозольную камеру.

 

12. На дисплее будет показано «Enter C.D. Time 1,800»; Это означает, что цикл распада занимает 1800 секунд. Установите «2,400» и нажмите Enter.

ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого цикла облако, накопившееся в аэрозольной камере во время небулайзерного цикла, может распадаться. Маленькие капли вдыхают экспериментальные животные.

13. На дисплее будет показано «Enter December Time 900»; это означает, что цикл дезактивации ультрафиолетовым светом займёт 900 секунд. Нажмите Enter. Машина начнёт циклично проходить предварительный нагрев, небулайзер, распад облаков и ультрафиолетовую дезактивацию.
    ВНИМАНИЕ: Вакуумный расходомер должен показывать 60 кубических футов/ч (проверьте начало предварительного нагрева; при необходимости регулировать клапан контроля вакуума), а расходомер сжатого воздуха — 10 кубических футов/ч (проверьте при начале цикла небулайзера; соответственно отрегулировать клапан управления воздухом).
14. Когда цикл завершён, клавиатура покажет сообщение «Процесс завершен – Удалить образец». Отключите программу, УФ и основной выключатель питания.
15. Проверьте, была ли микобактериальная суспензия полностью небулайзерована, а если нет — запишите оставшийся объём, аккуратно снимая подвеску с помощью соответствующего шприца с иглой для тупой игли на 18 G. Оставшийся объём не должен превышать 1 мл.
16. Снимите небулайзер из суставов и поместите его в кастрюлю с 2% буратоном минимум на 2 часа, обычно проводится дезинфекция O/N. После этого переложите небулайзер в свежую кастрюлю и тщательно промойте водой. Оставьте небулайзер сушиться на воздухе.
17. Откройте аэрозольную камеру и верните животных в клетки. Упаковывайте корзины в пакеты автоклава и автоклав. Протрите внутреннюю поверхность аэрозольной камеры 2% Buraton.

ПРИМЕЧАНИЕ: По соображениям безопасности во время этой процедуры следует носить электрический респиратор для очистки воздуха.

18. Используя оставшиеся 500 мкл суспензии микобактериальной суспензии (см. шаг 1.3), на пластинах 7H11 разбавлять в 10-кратное разбавление технического тройного экземпляра (3 x 100 мкл).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Буратон	Шюльке		Активные ингредиенты: альдегиды (формальдегид, глутаральдегид, оксалальдегид, этилгексанал)
Миддлбрук 7H9	Sigma	M0178	Для культур бульонов горы
Миддлбрук 7H11	BD Biosciences	283810	Агар-среда для культуры горы
Среда обогащения Middlebrook OADC	BD Biosciences	212240	Добавьте к 7H9 и 7H11 для культуры Mtb
Система ингаляционного воздействия	Глас-Кол
Небулайзер-Вентури	Глас-Кол