Биолюминесцентная визуализация бактериальных инфекций у мышей

Аннотация

Источник: de Vries, C. R. и др., Модель отложенной инокуляции хронической инфекции раны Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется метод биолюминесцентной визуализации для мониторинга прогрессирования бактериальной инфекции в модели живой мыши. Патогенные бактерии, сконструированные с помощью репортерской системы luxABCDE , излучают свет в месте заражения, позволяя визуализировать метаболически активные бактерии. Снимая мышь со временем, исследователи могут неинвазивно отслеживать динамику инфекции и количественно оценивать интенсивность биолюминесцентного сигнала.

Протокол

1. Подготовка и рост бактерий

1. Проводите всю работу с P. aeruginosa и животными с соблюдением мер предосторожности BSL-2 в соответствии с руководящими принципами институционального комитета по биобезопасности исследователя и комитета по использованию животных. Выполните все описанные здесь этапы, связанные с P. aeruginosa, включая прививку мышей, в шкафчике с биобезопасностью.
2. Люминесцентный штамм P. aeruginosa PAO1:lux доступен в нашей лаборатории по запросу. Streak PAO1, хранящийся в виде замороженного глицеролового бульона, на Lysogeny Broth (LB) агаре. Для люминесцентного штамма PAO1:lux LB агар должен содержать селективные антибиотики (100 мкг/мл карбенициллина и 12,5 мкг/мл канамицин). Выращивайте ночью при 37 °C в бактериальном инкубаторе.
3. Выберите изолированную колонию и выращите на ночь при 37 °C в средней температуре 3 мл фунтов, pH 7,4. Для люминесцентных штаммов бульон должен содержать 100 мкг/мл карбенициллина. Расти в трясущих, аэробных условиях.

2. Подготовка процедуры

1. Пусть весь персонал, выполняющий операцию, будет носить чистый халат/лабораторный халат, маску, сетку для волос и перчатки.
2. Автоклав — все хирургические инструменты, включая ножницы и щипцы. Используйте асептическую технику для стерилизации инструментов между животными.
3. Очистите хирургический стол этанолом и подготовьте чистое хирургическое поле.

3. Удаление волос

1. Анестезия мышей C57BL/6J возрастом 8–12 недель с использованием 1%–3% изофлурана. Исследователям следует следовать рекомендациям ветеринарного персонала своего учреждения по анестезии при использовании изофлурана.
   1. Начинайте анестезию, подав 1%–3% изофлурана и регулируйте поток кислорода до 1,5 л/мин. Поместите мышь в камеру впуска.
   2. Щипнуть мыши за палец ноги, чтобы оценить глубину анестезии. Когда мышь перестаёт реагировать на стимуляцию, вынимите её из индукционной камеры и поместите на хирургическую скамью, положив нос в конус изофлурана.
   3. Нанесите глазную смазку на оба глаза.
2. Взвесьте мышь, чтобы получить базовый вес до процедуры.
3. Положите мышь в положение лежа. Введите мыши подкожно предварительно нагретый стерильный хлорид натрия 0,9%, по 250 мкл на каждую сторону, всего 500 мкл.
4. Сбрийте спинную часть мыши с помощью электробритвы. Бритьё следует проводить в другом месте, отличном от хирургической станции, чтобы предотвратить загрязнение раны волосами.
5. Нанесите тонкий слой лосьона для удаления волос. Дайте лосьону постоять 20–60 секунд. Удалите волосы и лишний лосьон марлей, смоченной в тёплой воде. После удаления волос переходите к процедуре эксцизионного нанесения ран.

4. Операция по удалению ран полной толщины

1. Вводите бупренорфин с устойчивым высвобождением 0,6–1 мг/кг подкожно, используя иглу 25 G в среднюю спинную область мыши. Медленный бупренорфин облегчает боль в течение 48–72 часов.
2. Продезинфицируйте место операции. Протрите спинную поверхность стерильным мазком бетадина. Протрите избыток бетадина стерильным спиртовым мазком. Это следует выполнять три раза (чередуя бетадин и спирт), проводя мазок, двигаясь от центра по кругу к краю. Дайте месту высохнуть на воздухе.
3. Создайте занавеску вокруг места операции стерильной марлей или пластиковой пленкой.
4. Растягайте кожу, натянутую каудально. Используйте стерильный кожный биопсионный пунш диаметром 6 мм, чтобы сделать первый разрез через левую спинную часть эпидермиса. Повторите это на правой спинной части кожи.
5. Используйте щипцы, чтобы закрыть кожу с центра левой очерченной раны. Урежьте эпидермальные и дермальные слои ножницами. Повторите на правой очерченной области раны, чтобы создать симметричные эксцизионные раны.
6. Промывайте раны 50 мкл стерильного физиологического раствора. Дайте месту операции и окружающей коже высохнуть на воздухе. Затем закройте раны и спину прозрачной плёнкой.
7. Положите мышь обратно в чистую клетку. В доме по одному животному в клетке.
8. Поставьте клетку на грелку и монитор, пока мышь не проснётся.
9. При проведении вышеуказанной операции на нескольких животных используйте горячий бусинный стерилизатор для очистки всех хирургических инструментов между животными.
10. Дайте мышам 24 часа на восстановление после хирургической процедуры и на формирование временного матрица раны над ранами перед вакцинацией бактерий.

5. Инокуляция P. aeruginosa

1. Разбавить за ночь культуру PAO1:lux до OD600 = 0,05 в 75 мл LB-среды с содержанием 100 мкг/мл карбенициллина и вырастить бактерии до ранней экспоненциальной фазы (_{OD 600} ≈ 0,3). Это займет примерно 2–3 часа.
2. Разбавить PAO1: люкс в PBS до концентрации (7,5 ± 2,5) x 10² CFU/mL. Обязательно подготовьте избыточный инокулюм, чтобы обеспечить достаточный объём и позволить сервовать после эксперимента. При транспортировке между объектами (например, из лаборатории в виварий), используйте двойное содержание в герметичной коробке, чётко помеченной как Biohazard.
3. Выполнять все работы с P. aeruginosa и мышами с использованием одобренных средств индивидуальной защиты в биологическом шкафе для биологической безопасности (BSC) уровня биобезопасности для животных уровня 2 (ABSL-2). Многоразовое оборудование, например весы, должно быть покрыто пищевой пленкой для предотвращения загрязнения.
4. Анестезия с использованием 3% изофлурана, как описано выше. Взвесьте мышь и запишите вес. Введите мыши подкожно предварительно нагретый стерильный хлорид натрия 0,9%, по 250 мкл на каждую сторону, всего 500 мкл.
5. Если прозрачная плёнка с мыши снялась за ночь, аккуратно удалите остатки корки и нанесите новую повязку.
6. Используйте 500 мкл туберкулинового защитного шприца 27 G, чтобы ввести 40 мкл суспензии PAO1:lux через прозрачную плёнку в каждую рану. Для неинокуляций/PBS-контроля ран следует использовать разные мыши, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение с противоположной стороны.
7. Положите мышь обратно в клетку на грелку и следите за её вниманием, пока она не проснётся. Всех мышей следует содержать по отдельности в отдельных клетках, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение.
8. Поставьте высококалорийную пищевую пасту, зажатую между пищевыми гранулами на полу клетки.
9. Используйте оставшийся инокулюм, чтобы нанести полоску на пластину ЛБ агара. Подсчитайте колонии, чтобы подтвердить количество введённых бактерий.

6. Визуализация инфицированных ран in vivo

1. Следуйте протоколам изоляции BSL-2 для транспортировки мышей к инструменту визуализации и обратно, включая использование вторичного контейнера. Будьте осторожны, чтобы не переносить и не уронять подстилку животных во время переноса мыши в индукционную камеру или инструмент для визуализации.
2. Индуцировать анестезию мыши с помощью вдыхания 1% – 3% изофлурана в индукционной камере.
3. После анестезии мышь поместите её в положение лежа в камере визуализации оптической системы визуализации, а нос — в носовом конусе изофлурана.
4. Откройте программу.
5. Параметры приобретения будут варьироваться в зависимости от количества животных, снимаемых одновременно, и интенсивности биолюминесценции. Основные параметры включают время экспозиции, биннинг, f/стоп и поле зрения (FOV). Наши стандартные начальные настройки: время экспозиции 30 секунд, binning low (2), f/stop 1.2 и FOV 25. Корректируйте эти настройки по мере необходимости, в зависимости от потребностей исследователя.
6. Анализируйте данные люминесценции с помощью программы визуализации. Люминесценция будет представлена как псевдоцветное изображение, наложенное на цветную фотографию мышей.
   1. Создайте область интереса (ROI) в месте раны и измерьте средний фиксированный поток (фотонов в секунду). Обратите внимание, что данные также можно отражать как излучение (фотоны/секунда/см²/стерадиан), но пока расстояние от платформы до камеры между изображениями остаётся постоянным, поток достаточн.
   2. Измерьте фон, создав ROI в случайной области на платформе. Вычтите фоновое количество фотонов в секунду.
   3. Экспортируйте данные в таблицу для дальнейшего анализа.
7. Проводите обследование, описанное выше, так часто, как и ежедневно, чтобы отслеживать прогрессирование инфекции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,9% инъекция хлорида натрия	Hospira	2484457
18 G x 1 стерильная игла	BD	305195
25 G x 1 1/5 стерильная игла	BD	305127
Спиртовой мазок	BD	326895
Программное обеспечение для визуализации Aura	Визуализация спектральных приборов	н/д
Бетадин	Компания Пердью Фредерик	19-065534
Buprenorphine SR LAB	Zoopharm	н/д
Самцы мышей C57BL/6J	Лаборатория Джексона	664
Одноразовый биопсийный пунш, 6 мм	Integra	33-36
Тонкие ножницы — карбид вольфрама	Тонкие научные инструменты	14568-09
Стеклянный бусиновый сухой стерилизатор	Аппаратура Гарварда	61-0183
Гранулированный агар	Биореагенты Fisher	BP9744
Грелка	Миллиард	804879481218
Инсулиновый шприц с иглой 28 G	BD	329461
Система визуализации Lago X	Визуализация спектральных приборов	н/д
Бульон LB	Биореагенты Fisher	BP1426
Шприц Leur-Lok 1 мл	BD	309628
Мини-триммер для животных Arco	Wahl Professional	919152
Лосьон для удаления волос Nair с детским маслом	Черч и Дуайт	н/д	Доступно в любой аптеке
Октагонные щипцы	Тонкие научные инструменты	11041-08
Чашка Петри	Falcon	351029
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) 1 раз	Корнинг	21-040-CV
Пресс и герметизация пищевой пленки	Рад	н/д
Инсулиновый шприц SafetyGlide с иглой 30 G	BD	305934
Инсулиновый шприц Safetyglide, 1/2 мл, 30 г x 5/16 ТВт	BD	305934
Масштаб	Ohaus Scout Pro	SP202
Пищевая добавка	Henry Schein Animal Health	29908
Тегадерма, 6 см x 7 см	3M	1624W