Коинфильтрационный анализ для скрининга эффекторов патогенов, подавляющих заглушание РНК растений

Аннотация

Источник: Ши, Дж . и др. Скрининг и идентификация РНК-подавляющих супрессоров из секретируемых эффекторов патогенов растений. J. Vis. Exp . (2020)

В этом видео демонстрируется коинфильтрационный анализ для выявления эффекторных белков патогена, подавляющих заглушание РНК у Nicotiana benthamiana 16c. Флуоресцентный репортер и кандидат-эффекторный ген вводятся в листья растений с помощью Agrobacterium. Обычно заглушание РНК разрушает репортерные транскрипты, снижая флуоресценцию. Супрессорные эффекторы блокируют этот ответ, сохраняя флуоресценцию. Этот анализ предлагает быстрый визуальный метод скрининга микробных эффекторов, мешающих защите хозяина.

Протокол

Совместная инфильтрация Nicotiana benthamianлистья

1. Смешайте равные объемы культуры Agrobacterium с 35S-GFP с культурой Agrobacterium , содержащей 35S-огуречный мозаичный вирусный супрессор 2b (CMV2b), предполагаемый эффектор или пустой вектор (EV).
2. Осторожно и медленно инфильтруйте смешанные суспензии агробактерий на абаксиальных сторонах листьев N. benthamiana 16c с помощью безиглового шприца объёмом 1 мл.
3. Удалите оставшуюся бактериальную суспензию с листьев с помощью мягкоочистителей и обведите края инфильтрированных участков ручкой-мейкером.
4. Оставьте инфильтрированные растения в камере роста при тех же условиях роста.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: По соображениям безопасности и здоровья при проникновении следует носить защитные очки и маску. Чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение, перчатки следует менять или стерилизовать этанолом между инфильтрациями. Обычно для инфильтрации требуется не менее 1 мл суспензии агробактерии на каждый лист. Для системного подавления потребуется как минимум два листа, чтобы проникать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
УФ-лампа	Аналитик Йена	UVP B-100AP	Наблюдение