Выделение бактерий из среднего кишечника комаров

Аннотация

Источник: Liu, X. и др. Бактериальный пероральный тест питания с помощью комаров, обработанных антибиотиками. J. Vis. Exp . (2020)

В этом видео демонстрируется вскрытие среднего кишечника комара для выделения бактерий кишечника. Средний кишечник извлекается из пищеварительного тракта, гомогенизируется для выделения бактерий и помещается на питательный агар для культивирования бактериальных колоний.

Протокол

1. Вскрытие среднего кишка комара
   1. Перенесите стерилизованного на поверхности комара на стеклянное стекло с каплей стерильного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Вскрытие под микроскопом для вскрытия.
   2. Под нижним увеличением микроскопа аккуратно удаляйте ноги, крылья и голову комара, чтобы предотвратить побег. Удалите последний сомит комара, разрезав напрямую, а не вытягивая его, чтобы предотвратить разрушение пищеварительного тракта.
   3. Зажмите грудь комара и конец живота щипцем. Аккуратно вытяните пищеварительный тракт комара. Приобретённый пищеварительный тракт обычно включает порождые, переднюю кишку, среднюю кишку, заднюю кишку и мальпигиевские трубки.
   4. Отрегулируйте дисектирующий микроскоп на большее увеличение. Извлеките из рассеченного пищеварительного тракта, чтобы получить середину кишечника, переднюю кишку, заднюю кишку и мальпигиеву трубку.
   5. Будьте осторожны при удалении посевов, так как после того, как комар получает сахарную муку, он раздувается и напоминает среднюю часть кишечника. Мальпигиевские трубки — группа длинных и тонких выделяющих трубок — расположены на границе между средним и задним кишечником.
2. Изолировать кишечные бактерии
   1. Перенесите расчленённый средний кишечник в стерильную трубку объёмом 1,5 мл с 200 мкл стерильного буфера 1x PBS.
   2. Тщательно измельчите середину кишечника на стерильном столе стерильным пестиком, чтобы полностью выпустить кишечные бактерии в буфер.
   3. Последовательно разведите гомогенат до трёх 10-кратных разбавлений. Добавьте 50 мкл каждого разбавления на тарелку для агара LB (бульон Лурия) и наложите на тарелку. Если в среднем кишечнике высокая концентрация кишечной флоры, необходимо проводить более серийные разбавления для выделения отдельных колоний.
   4. Инкубировать пластину при 37 °C в течение 1–2 дней, пока не появятся отдельные колонии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Aedes aegypti			Самки комаров
Центрифугная трубка	Sangon Biotech	F601620-0010	1,5 мл, натуральный, стерильный
Одноразовый товщик для измельчения тканей	Sangon Biotech	F619072-0001	70 мм длиной, конической, синей, стерильной
Щипцы	Задний привод	F11029	Вскрытие
Порошок ЛБ агар	Sangon Biotech	A507003	Триптон 10,0 г, экстракт дрожжей 5,0 г, NaCl 10,0 г, Агар 15,0 г.
Микроскоп	Zeiss	Stemi508
10X PBS-буфер	Sangon Biotech	E607016	Этот продукт — решение 10X. Пожалуйста, разведите его 10 раз перед использованием. Значение pH составляет 7,4.