Формирование определённой популяции бактерий в кишечнике у взрослых комаров

Аннотация

Источник: Liu, X. и др. Бактериальный пероральный тест питания с помощью комаров, обработанных антибиотиками. J. Vis. Exp . (2020)

В этом видео демонстрируется истощение родной кишечной микробиоты у комаров с помощью антибиотикосодержащего сахарозного раствора. Затем следует контролируемая реколонизация с помощью бактериальной суспензии, подаваемой через мембранную систему питания для формирования определённой популяции бактерий в кишечнике комаров.

Протокол

1. Лечение антибиотиками и повторное введение бактерий

1. Приготовьте антибиотиковый раствор.
   1. Взвесьте необходимое количество сахарозы, пенициллина и стрептомицина для приготовления 10% сахарозного раствора, включая 20 единиц пенициллина и 20 мкг стрептомицина на мл.
2. Кормите комаров антибиотиком.
   1. Анестезируйте комаров при температуре 4 °C в течение 3–5 минут. Переложите комаров в бумажный стаканчик. Накройте сверху марлей и оберните марлю лентой, чтобы не дать комарам выбраться.
   2. Окуните стерильные ватные шарики в антибиотик и аккуратно положите их на чашку от комаров. Сжимайте ватные шарики перед использованием, чтобы комары не утонули в капающих ватных шариках.
   3. Накройте ватные шарики чашкой Петри диаметром 10 см, чтобы предотвратить испарение влаги. Меняйте ватные шарики два раза в день в течение трёх подряд дней.
3. Подготовка бактериальной суспензии
4. Измерьте бактериальный раствор с помощью спектрофотометра. Добавьте 1 бактериальную суспензию OD (OD₆₀₀) в трубку объемом 1 мл. Центрифугуйте подвеску при 5 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
5. Сбросьте супернатант и добавьте 1 мл стерильного 1x PBS-буфера в трубку объемом 1,5 мл для суспензионного осадка.
6. Центрифуга при 5 000 x g в течение 5 минут при 4 °C; Отбросьте супернатант.
7. Повторите шаги 2.4.2 и 2.4.3.
8. Добавьте 200 мкл стерильного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в бактериальный осадок.
9. Добавьте 600 мкл 10% раствора сахарозы, 200 мкл 10 мм аденозинового 5′-трифосфата (АТФ), который действует как фагостимулятор, и 200 мкл бактериальной суспензии в стерильную трубку объёмом 1,5 мл. Смешивайте с помощью вихря.
10. Кормите комара бактериальной суспензией.
    1. Морьте комаров голодом в течение 24 часов, чтобы антибиотики метаболизировали перед кормлением бактериями.
    2. Соберите систему питания через мембрану.
    3. Герметизируйте стерилизованный подавающий блок парапленкой или, альтернативно, коллагеновой мембраной.
    4. Наденьте пластиковое кольцо и закрепите его парапленкой, чтобы не сломаться из-за трения во время кормления.
    5. Медленно добавляйте подготовленный бактериальный раствор в кормушку.
       Примечание: Раствором можно заполнить только одну скважину двухколодного питающего блока, а подавающий блок можно закрыть только со стороны сбрасывания реагентов.
    6. Подключите питание к системе подачи, предварительно нагретой до 37 °C, которая имитирует температуру человека для привлечения комаров. Поставьте устройство для кормления на бумажный стаканчик, наполненный комарами, и кормите 90 минут.
    7. После кормления унесите комаров, подвергая их температуре 4 °C в течение 3–5 минут и держите их под анестезией в ледяной чашке Петри.
    8. Для дальнейшего изучения выбирайте полностью раздутых комаров.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Гидрат соли-гидрата аденозина 5′-трифосфат динатрия	Sigma	A2383	Гидрат солиди аденозин 5′-трифосфат используется для получения стандартных растворов аденозинтрифосфата (АТФ)
Мембранная система питания Hemotek	Hemotek		Компоненты системы подачи, включая регулятор температуры Hemotek, сборку корпуса подачи, сборку металлической подачи.
Парафильм	Sangon Biotech	F104002	4 дюйма x 125 футов
Чашка Петри	Sangon Biotech	F611203
Гидрат соли-прокаина пенициллин G	Sangon Biotech	A606248	Белый порошок. Растворим в воде, растворим в метаноле, слегка растворим в воде, этанол
Стрептомицин сульфат	Sangon Biotech	A610494	Стрептомицинсульфат — это антибиотик на основе глюкозамина, который мешает синтезу прокариотических белков.
Сахароза	Sangon Biotech	A502792	Растворим в воде, этаноле и метаноле, слабо растворим в глицериле и пиридине.
10X PBS-буфер	Sangon Biotech	E607016	Этот продукт — решение 10X. Пожалуйста, разведите его 10 раз перед использованием. Значение pH составляет 7,4.